試料中に存在する目的ヌクレオチド配列を検出するための核酸プローブの使用

专利摘要:
本発明は、試料中に存在する核酸配列の同定方法および検出方法に関する。該核酸はＲＮＡあるいはＤＮＡ、またはその両方であってもよい。本発明はさらに、試料中に種々の微生物が存在するかどうか、またその種が何であるかを判定するための方法に関する。さらに、出願人らは、グラム陰性菌のｒＲＮＡ内に存在する１組のオリゴヌクレオチドの核酸配列を突き止めた。この１組をプールしてまたは組み合わせて使用することで、たとえばハイブリダイゼーション分析等において、グラム陰性菌を大まかな分類として同定することが容易となる。この１組のオリゴヌクレオチドは、グラム陰性菌の大まかな分類に属する生物の存在を示す配列を検出する一方、グラム陽性菌や真菌または他の微生物等を誤って同定してしまう可能性はほとんどあるいはまったくない。この分析は、少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列と、少なくとも１つの核酸プローブと、フッ素界面活性剤と、ヌクレアーゼとを同時にインキュベートすることを含む。この分析はまた、試料中に存在する標的核酸配列を検出および／または同定するために、または、さらにまた別の特異的プローブを使用することによって、細菌、真菌または他の微生物を検出するために使用してもよい。本発明はさらに、結合分析において、非特異結合を低減させて複合体の形成を促進する方法に関する。この結合分析は核酸ハイブリダイゼーション分析または免疫測定であってもよいが、これらに限定されない。本発明はさらに、少なくとも１つの目的とする標的（ヌクレオチド配列であってもよい）と、少なくとも１つのプローブ（核酸プローブであってもよい）と、ヌクレアーゼとを使用する検出方法に関する。
公开号:JP2011510630A
申请号:JP2010544454
申请日:2009-01-23
公开日:2011-04-07
发明作者:ウォンブル，クリスティー，イー．；シモンズ，スティーブン，ジェイ．；セミナラ，サル；セラパン，サブラマニ；ドーソン，エリオット，ピー．；ハーン，アンドリュー；ベーカー，ジェニファー，エム．；マッデン，ジュディス；レイ−コックス，ローリ，ジェイ．
申请人:セルシス インターナショナル リミテッド；バイオベンチャーズ，インコーポレイテッド；
IPC主号:C12Q1-68

专利说明:

[0001] 本出願は、２００８年１月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／０２３，３４８号に基づく優先権を主張する、２００９年１月２３日に出願された米国特許出願第１２／３５９，２６３号に基づく優先権を主張するものであり、これらの出願は参照によりその全体が本出願に組み込まれる。]
[0002] 本発明は、試料中に存在する目的核酸配列の同定方法および検出方法に関する。該核酸はＲＮＡあるいはＤＮＡ、またはその両方であってもよい。本発明はさらに、試料中に種々の微生物が存在するかどうか、またその種が何であるかを判定するための方法に関する。さらに、出願人らは、グラム陰性菌のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）内に存在する１組のオリゴヌクレオチドの核酸配列を突き止めた。この１組をプールしてまたは組み合わせて使用することで、たとえばハイブリダイゼーション分析等において、グラム陰性菌を大まかな分類として同定することが容易となる。この１組のオリゴヌクレオチドは、グラム陰性菌の大まかな分類に属する生物の存在を示す配列を検出する一方、グラム陽性菌や真菌または他の微生物等を誤って同定してしまう可能性はほとんどあるいはまったくない。この分析はまた、試料中に存在する標的核酸配列を検出および／または同定するためだけでなく、さらにまた別の特異的プローブを使用することによって、細菌、真菌または他の微生物を検出するために使用してもよい。]
[0003] 本発明はさらに、少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列と、検出可能な標識で標識した少なくとも１つの核酸プローブと、任意でフッ素界面活性剤とヌクレアーゼとを同時にインキュベートすることを含む分析に関する。この分析はまた、さらにまた別の特異的プローブを使用することによって、裸のヌクレオチド配列だけでなく、細菌、真菌または他の微生物を検出するために使用することができ、また試料中に存在する標的核酸配列を検出および／または同定するために使用してもよい。本発明はさらに、結合分析において、非特異結合を低減させて複合体の形成を促進する方法に関する。この結合分析は、免疫測定、マイクロ流体分析、ベッセルの不動態化、細胞培養または核酸ハイブリダイゼーション分析であってもよいが、これらに限定されない。本発明はさらに、少なくとも１つの目的とする標的（これはヌクレオチド配列であってもよい）と、少なくとも１つのプローブ（たとえば核酸プローブ）と、ヌクレアーゼとを使用する検出方法に関する。検出可能なその他の分子および化合物としては、タンパク質、ペプチド、小型化学分子（ｓｍａｌｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、炭水化物、リポ多糖、多糖、脂質等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明はさらに、このような分析を行うためのキットに関する。]
背景技術

[0004] ウイルスを除くあらゆる生物は、各細胞にリボソームを含み、したがってリボソームＲＮＡを含む。リボソームは３つの別個の一本鎖ＲＮＡ分子、すなわち巨大分子と中型分子と小型分子とを含む。２つの大きいｒＲＮＡ分子は、生物によってその大きさが異なる。リボソームＲＮＡは直接の遺伝子産物であり、ｒＲＮＡ遺伝子によってコードされる。この遺伝子のＤＮＡ配列は、ｒＲＮＡ分子を合成するためのテンプレートとして使用される。ｒＲＮＡサブユニットの各々に対し、別個の遺伝子が存在する。大部分の生物には複数のｒＲＮＡ遺伝子が存在し、核ｒＲＮＡ遺伝子とミトコンドリアｒＲＮＡ遺伝子との両方を有する多くの高等生物も、これに含まれる。植物および他の特定の生物は、核ｒＲＮＡ遺伝子、ミトコンドリアｒＲＮＡ遺伝子および葉緑体ｒＲＮＡ遺伝子を有する。単純化するために、これら３つの別個のｒＲＮＡ遺伝子をまとめてｒＲＮＡ遺伝子と呼ぶこととする。]
[0005] あらゆる生物のあらゆる細胞中に、多数のリボソームが存在する。典型的な細胞では、トータルＲＮＡの約８５〜９０％がｒＲＮＡである。大腸菌等の細菌は、細胞１個当たり約１０４個のリボソームを含み、一方哺乳動物の肝細胞は、１個当たり約５×１０６個のリボソームを含む。各リボソームが各ｒＲＮＡサブユニットのうち１つを含むため、細菌細胞および哺乳細胞は、各ｒＲＮＡサブユニットをそれぞれ１０４個および５×１０６個含む。]
[0006] リボソームＲＮＡ以外のリボ核酸、特にメッセンジャーＲＮＡは、同定、代謝あるいは病気の状態、またはＲＮＡウイルスやＤＮＡウイルスによる活動性ウイルス感染の有無を判定する上で非常に有用である。転写産物の同定および発現レベルの測定のうちいずれかまたは両方を実施することにより、種々の品質管理分析だけでなく診断法および生命科学の研究においても多大な恩恵がもたらされる。マイクロＲＮＡ等の、ＲＮＡのさらなる形態の測定も同様に、診断測定、特にがんにおける測定において、非常に有益であり得る。]
[0007] 当技術分野でよく知られた方法である核酸ハイブリダイゼーションは、非関連配列が過剰に存在する状況下においても、極めて少量または大量の特定の核酸配列を特異的に検出するために使用されてきた。従来技術における核酸ハイブリダイゼーションの使用については、細胞およびウイルスの遺伝子発現、細胞およびウイルスの分子遺伝学、生物の遺伝子解析、生物および核酸配列の進化論および分類学、疾患過程における分子機構、ならびに細胞および生物内のウイルスおよび細菌の検出を含む、特定の目的のための診断法に関する出版物に多くを見出すことができる。]
[0008] おそらく、最も特性決定がなされ、かつ最もよく研究されている遺伝子および遺伝子産物と言えば、ｒＲＮＡ遺伝子およびｒＲＮＡであろう。従来技術には、生物およびリボソーム遺伝子配列の進化論的・分類学的分類だけでなく、遺伝子解析におけるｒＲＮＡとリボソーム遺伝子とのハイブリダイゼーションの使用が含まれる。遺伝子解析には、たとえば、種々の生物中のリボソームＲＮＡ遺伝子の数、細胞中に存在する複数のリボソームＲＮＡ遺伝子の類似性、ならびに細胞中のｒＲＮＡ合成の速度と程度およびそれらをコントロールする要因を判定することが含まれる。進化論的・分類学的研究は、ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を、関連する生物および大きく異なる生物からのものと比較することを含むことが多い。]
[0009] リボソームＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列は、大きく異なる生物間においても、その少なくとも一部は類似していることが知られている。たとえば、大腸菌の細菌性リボソームＲＮＡ遺伝子のＤＮＡは、植物、哺乳動物および種々の細菌種のｒＲＮＡとハイブリダイズする。このような他の種とハイブリダイズする大腸菌遺伝子断片は、生物の類似度によって異なる。実質的には、あらゆるｒＲＮＡ遺伝子配列が近縁種のｒＲＮＡとハイブリダイズするが、遠縁種のｒＲＮＡとはそれほどハイブリダイズしない。]
[0010] 特定の生物群のｒＲＮＡに特異的なプローブを利用することによってその群を検出する際の感度および容易さは、各細胞中に一本鎖の核酸分子として存在する多数の両ｒＲＮＡ分子によって大いに高められる。しかしながら、このｒＲＮＡは一本鎖の分子ではあるが、通常とは異なる非常に複雑な二次構造・三次構造をとっているため、特定のセグメントにプローブが極めて到達しにくい可能性がある。溶液中で変性させたとしても、このｒＲＮＡがスナップバックしてこのような二次構造・三次構造を再構成しようとする傾向は、部分的にしか緩和されない。このスナップバックは分子内でのリフォールディングであって拡散律速ではないため、この傾向は急速に生じる。この問題を克服するために、ＲＮＡを変性させ、ニトロセルロースもしくはその他の支持体に吸着させる等の技術を使用して、この変性状態のＲＮＡを固定化してもよく、あるいは標的セグメントの内部相補体よりも融解温度（Ｔｍ）の高いプローブを使用して、リボソーム分子の自己アニールを妨害してもよい。]
[0011] また、ｒＲＮＡだけでなく、他の種類の細胞核酸に特異的なｒＲＮＡプローブを使用し、核酸ハイブリダイゼーションすることによって、特定の生物群または細胞群を検出、同定、または定量してもよい。たとえば、ｒＲＮＡは、約６０００の塩基長を有する前駆体分子として、細菌である大腸菌内で合成される。次いでこの前駆体分子が処理され、ｒＲＮＡサブユニット（総塩基数約４５００）といくつかの余分なＲＮＡ配列（総塩基数１５００）とが生成するが、前者はリボソームに取り込まれ、後者は廃棄される。]
[0012] よく知られた増幅方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。ＰＣＲでは、目的とする特定のヌクレオチド配列における特徴的な断片を、特定のプライマーを用いて増幅する。このプライマーが標的部位を見つけると、遺伝物質の配列が１００万倍に増殖する。]
[0013] ＰＣＲの過程において、生じたＤＮＡは、複製のテンプレートとして使用される。これによって連鎖反応が起こり、ＤＮＡテンプレートが指数関数的に増幅される。ＰＣＲによれば、１つのＤＮＡ断片の１〜数コピーを利用して数桁の増幅を行い、数百万あるいはそれ以上のＤＮＡ断片コピーを得ることができる。ＰＣＲは、多様な遺伝子操作を行うために広範囲な変更を行うことができる。]
[0014] ＰＣＲアプリケーションでは、ほとんどすべての場合に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用する。その一例として、もともと好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離された酵素であるＴａｑポリメラーゼが挙げられる。このＤＮＡポリメラーゼは、テンプレートとしての一本鎖ＤＮＡおよびＤＮＡ合成の開始に必要なＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＤＮＡプライマーとも呼ばれる）を使用し、ＤＮＡ構成要素であるヌクレオチドから新たなＤＮＡ鎖を酵素的に構築する。大多数のＰＣＲ法は、温度サイクルを使用しており、つまり、あらかじめ定められた一連の温度ステップに従い、ＰＣＲ試料の加熱と冷却とを交互に繰り返す。これらの温度サイクルステップは、低温でのＤＮＡ合成においてＤＮＡポリメラーゼが標的ＤＮＡを選択的に増幅するためのテンプレートとして使用するＤＮＡ二重らせんの鎖を、高温で物理的に分離（ＤＮＡ融解）するために必要である。ＰＣＲの選択性は、特定の温度サイクル条件下で増幅を行う標的とするＤＮＡ領域に相補的なプライマーの使用に起因する。]
[0015] ＰＣＲ反応は、通常サイクルと呼ばれる、２０〜４０回繰り返される一連の温度変化からなる。各サイクルは、一般的には、２〜３の別個の温度ステップからなる。最も一般的なＰＣＲ増幅は、３つの温度ステップを有するサイクルを用いて実施される。温度サイクルは、高温（＞９０℃）における一定温度のステップ（ホールドと呼ばれる）で始まることが多く、次いで最終産物を伸長または短期保存するための１ホールドで終了する。用いる温度、および各サイクルにおけるそれらの温度の持続時間は、種々のパラメータに依存する。パラメータとしては、ＤＮＡ合成に用いる酵素、反応における二価イオンおよびｄＮＴＰの濃度、ならびにプライマーの融解温度（Ｔｍ）が挙げられる。]
[0016] 開始ステップでは、約９４〜９６℃（耐熱性の非常に高いポリメラーゼを使用する場合は９８℃）まで反応温度を上げ、その温度を１〜９分間維持する。このステップを必要とするのは、ホットスタートＰＣＲによる熱活性化を必要とするＤＮＡポリメラーゼのみである。]
[0017] 熱変性ステップは通常のサイクルにおける最初のイベントであり、９４〜９８℃まで反応温度を上げ、２０〜３０秒間維持することからなる。このステップで、ＤＮＡ鎖の相補的塩基対間の水素結合が破壊され、ＤＮＡテンプレートおよびプライマーが融解して、ＤＮＡの一本鎖が生成する。]
[0018] 次いで、アニーリングステップ反応では、温度を約５０〜６５℃に低下させて２０〜４０秒間維持することによって、プライマーをアニーリングさせ一本鎖ＤＮＡテンプレートを生成する。一般に、アニーリング温度は、使用するプライマーのＴｍよりも約３〜５℃低くする。プライマー配列がテンプレート配列と厳密に一致する場合にのみ、安定したＤＮＡ−ＤＮＡ水素結合が形成される。ポリメラーゼはこのプライマーとテンプレートとのハイブリッドに結合し、ＤＮＡ合成を開始する。]
[0019] 伸長ステップの温度は、使用するＤＮＡポリメラーゼに依存する。たとえば、Ｔａｑポリメラーゼの最適活性温度は約７５〜８０℃であり、この酵素は一般に７２℃で使用される。このステップで、ＤＮＡポリメラーゼは、テンプレートであるＤＮＡ鎖に対して５’→３’方向に相補的なｄＮＴＰを加えることにより、ｄＮＴＰの５’位のリン酸基と新生（伸長しつつある）ＤＮＡ鎖の３’位の水酸基とを縮合させ、テンプレートに相補的な新しいＤＮＡ鎖を合成する。伸長時間は、使用するＤＮＡポリメラーゼ、および増幅するＤＮＡ断片の長さに依存する。ＤＮＡポリメラーゼは、最適温度においては、一般に１０００塩基／分の速度で重合を行う。最適条件下、すなわち、制限基質や制限試薬による制限がない条件下では、各伸長ステップにおいて標的ＤＮＡの量は２倍になり、特定のＤＮＡ断片が指数関数的（幾何学的）に増幅される。]
[0020] 最後のＰＣＲサイクルの後、残っている一本鎖ＤＮＡを完全に伸長するため、７０〜７４℃で５〜１５分間の最終的な伸長を行うこともある。反応物の短期保存のために４〜１５℃の最終ホールドを実施してもよい。]
[0021] 上記の分析において、たとえば、ＤＮＡ断片を分離するアガロースゲルを使用して、定性的評価を行ってもよい。最も単純なケースでは、この定性的評価は、プライマーが標的とする部位が分析試料中に存在するという情報を提供するものである。]
[0022] ＰＣＲ技術から発展したまた別の技術として定量的ＰＣＲがあるが、これは、存在する微生物量と増幅されたＤＮＡ量との相関を確立しようとするものである。さらに、逆転写酵素ＰＣＲでは、試料中のＲＮＡ種の検出が可能であり、検出されたＲＮＡを利用して、生きている生物か死んだ生物か、またはフリーのＤＮＡであるかを識別することができる。しかしながら、偽陽性の発生を防止し、試料中のＲＮＡからの増幅産物のみを生成させるため、試料中のＤＮＡは徹底的に除去しなければならない。]
[0023] ＰＣＲの長所として、特異性が高いこと、および比較的短時間で実施できることが挙げられる。主な短所は、汚染による影響を受けやすく偽陽性が発生しやすいこと、逆転写酵素ＰＣＲを行われなければ上記した生細胞、死細胞、裸のＤＮＡの識別ができないこと、および、阻害物質の存在に起因する偽陰性が発生する危険性があることである。これらの短所の多くは、適切な実験室的手技やプロトコル設計の適用により克服できるが、それにはコスト、装置、設備条件、時間、および実施に必要な専門知識をかなり増やさなければならないことが想定され得る。]
[0024] 蛍光標識したオリゴヌクレオチドを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの使用もまた別の有用な方法であり、これは１９９０年代の初めに開発された。この方法は、多くの環境試料において成功裏に使用されており、（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｉｎｇ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ，ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ，ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１７２（２）Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．７６２−７７０（１９９０））、一般に「ＦＩＳＨ」（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）として知られている。ＦＩＳＨ技術は、試料中に存在する微生物を特異的に検出するためのツールであり、あらゆる細胞に存在するリボソームリボ核酸（リボソームＲＮＡ）が、保存性の高い配列と可変（すなわち属特異的さらには種特異的）配列とをいずれも有することを前提としている。相補的なオリゴヌクレオチドは、これらの配列ドメインに対して生成され、さらに、微生物の種、属または群の識別を可能にする、検出可能なマーカーで標識されてもよい。ＦＩＳＨ法は、生物群集の実際のｉｎ ｓｉｔｕ条件を歪みなく示し、培養も記述もされていない微生物を同定できる可能性のある方法として、一般に知られている唯一の方法である。]
[0025] ＦＩＳＨでは、プローブが分析試料中の細胞に入り込み、細胞内の標的配列に結合するため、プローブの標識による細胞の検出が可能となる。ＦＩＳＨはまた、従来の培養では検出の難しい微生物を同定するために使用されてもよく、これによって多くの試料中の微生物集団の検出が可能となる。ＦＩＳＨは、培養による検出よりも迅速に微生物を検出するために使用されてもよい。]
[0026] ＦＩＳＨはさらに、細胞および／または組織を可視化することによって、特定の形態を同定するために使用されてもよい。阻害物質の存在による偽陰性は、汚染に起因すると考えられる偽陽性と同程度に排除することができる。]
[0027] ここ数年の間に、分子生物学に関する多くの文献が公表されている。これらの文献は、微生物の培養プロトコル、ｒＲＮＡのような核酸の構造および機能、微生物の同定に関する方法、核酸ハイブリダイゼーション技術、および核酸プローブの決定について開示している。]
[0028] 以下の文献は、細菌および他の微生物を培養し、核酸を抽出するためのプロトコルおよび方法に関する。
Ｂｒｉａｎ Ｗ．Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ：ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｐｈａｇｅｓ ｉｎＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬＡＰＰＲＯＡＣＨ ｘｖ−ｘｖｉｉ，２１−５４（Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ，ｅｄ．２０００）；
Ｌａｕｒａ Ｇ．Ｌｅｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅａｍ Ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ，６１（３）ＡＰＰＬ．ＥＮＶＩＲＯＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．１１４１−１１４３（１９９５）；
Ｙｕ−Ｌｉ Ｔｓａｉ＆Ｂｅｔｔｙ Ｈ．Ｏｌｓｏｎ，Ｒａｐｉｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｉｒｅｃｔ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｓｏｉｌ ａｎｄ Ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ，５７（４）ＡＰＰＬ．ＥＮＶＩＲＯＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．１０７０−１０７４（１９９１）；
ＴＥＣＨＮＯＴＥ ３０２ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．２００２）．]
[0029] 以下の文献は、リボソームＲＮＡの構造および機能の研究に関する。
Ｓｅｂａｓｔｉａｎ Ｂｅｈｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｉｔｙ ｏｆ Ｓｍａｌｌ−ＳｕｂｕｎｉｔｒＲＮＡｏｆ Ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ａｒｃｈａｅａ，ａｎｄ Ｅｕｃａｒｙａ ｔｏ Ｃｙ３−Ｌａｂｅｌｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ，６９（３）ＡＰＰＬ．ＥＮＶＩＲＯＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．１７４８−１７５８（２００３）；
Ｓｏｕｍｉｔｅｓｈ Ｃｈａｋｒａｖｏｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｄｅｔａｉｌｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ，６９（２）Ｊ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．ＭＥＴＨＯＤＳ ３３０−３３９（２００７）；
Ｄａｒｒｅｌｌ Ｐ．Ｃｈａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖｅｒｓｕｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｏｎ Ｐｌａｎａｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，６９（５）ＡＰＰＬ．ＥＮＶＩＲＯＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．２９５０−２９５８（２００３）；
Ｂｅｒｎｈａｒｄ Ｍ．Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．，Ｕｎｌａｂｅｌｅｄ Ｈｅｌｐｅｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ １６Ｓ ＲＮＡ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ，６６（８）ＡＰＰＬ．ＥＮＶＩＲＯＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．３６０３−３６０７（２０００）；
Ｄａｎｉｅｌｌｅ Ａ．Ｍ．Ｋｏｎｉｎｇｓ＆Ｒｏｂｉｎ Ｒ．Ｇｕｔｅｌｌ，Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｆｏｌｄｉｎｇｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ １６Ｓ ａｎｄ １６Ｓ−ｌｉｋｅ ｒＲＮＡｓ，１ ＲＮＡ ５５９−５７４（１９９５）；
Ｈａｒｒｙ Ｆ．Ｎｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｂｅｓ，８（３＆４）ＰＲＯＣ．ＩＮＴ．ＳＹＭＰ．ＢＩＯＭＯＬ．ＳＴＲＵＣＴ．ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＯＮＳ，ＳＵＰＰＬ．Ｊ．ＢＩＯＳＣＩ．７４７−７５５（１９８５）；
Ａｌｅｘ Ｐｏｚｈｉｔｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｓｔｓ ｏｆ ｒＲＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｃａｎｎｏｔ ｂｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ，３４（９）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．ｅ６６（２００６）；
Ｍｉｇｕｅｌ Ａｎｇｅｌ Ｒｅｙｅｓ−Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ａｎｄ ｖｉｒｔｕａｌ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，３１（２）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．７７９−７８９（２００３）；
Ａｃｈｉｍ Ｓｃｈｍａｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ ｔｏ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｍａｌｌ−Ｓｕｂｕｎｉｔ ｒＲＮＡ Ｇｅｎｅ ｉｎＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ，６７（８）ＡＰＰＬ．ＥＮＶＩＲＯＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．３５５７−３５６３（２００１）；
Ｓ．−Ｃ．Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｏｏｍ−Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｗｉｔｈ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｉｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ Ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，３４（６）ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ １２６１，１２６２（２００３）；
Ｃ．Ｒ．Ｗｏｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａｌ １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ：ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ，ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ，８（１０）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．２２７５−２２９３（１９８０）；
Ｌ． Ｓａｆａｋ Ｙｉｌｍａｚ＆Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｎｏｇｕｅｒａ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ Ｐｒｏｂｌｅｍ ｏｆ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，７０（１２）ＡＰＰＬ．ＥＮＶＩＲＯＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．７１２６−７１３９（２００４）；
Ｌ． Ｓａｆａｋ Ｙｉｌｍａｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｋｉｎｇ Ａｌｌ Ｐａｒｔｓ ｏｆ ｔｈｅ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ ｔｏ Ｓｉｎｇｌｅ ＤＮＡ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，７２（１）ＡＰＰＬ．ＥＮＶＩＲＯＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．７３３−７４４（２００６）．]
[0030] 以下の文献は、細菌および他の微生物の同定および識別に関する。
Ｓｖｅｎ Ｋｌａｓｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｇｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ，４０（１１）Ｊ．ＣＬＩＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．４３０４−４３０７（２００２）；
Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｍ．Ｍａｒｌｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｒＲＮＡＰｒｏｂｅ Ｍａｔｒｉｘ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｆｕｎｇｉ ｆｒｏｍ Ｒｏｕｔｉｎｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，４１（１１）Ｊ．ＣＬＩＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．５１２７−５１３３（２００３）．]
[0031] 以下の文献は、分子生物学におけるハイブリダイゼーション技術の使用に関する。
Ｆｒａｎｃｏｉｓ Ｃｏｕｔｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｂｙ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，２６５（２０）Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．１１６０１−１１６０４（１９９０）；
Ｇａｒｙ Ｋ． ＭｃＭａｓｔｅｒ＆Ｇｏｒｄｏｎ Ｇ．Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ， Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ− ａｎｄ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓｏｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ａｎｄ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｇｌｙｏｘａｌ ａｎｄ ａｃｒｉｄｉｎｅ ｏｒａｎｇｅ，７４（１１）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ４８３５−４８３８（１９７７）；
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ＧｅｎｏｍｉｃＥＳＣｅｌｌ ＤＮＡ．]
[0032] 以下の文献は、ＡＲＢソフトウェア（ＡＲＢは樹木を意味するラテン語のａｒｂｏｒに由来する）を使用した場合の、リボソームＲＮＡプローブのアクセシビリティに関する。
Ｙａｄｈｕ Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒａｐｈｉｃａｌ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｐｒｏｂｅ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ＡＲＢ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ，６ＢＭＣＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ６１（２００５）；
Ｙａｄｈｕ Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ ｗｉｔｈ ｒｅｓｐｅｃｔ ｔｏ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｕｓｉｎｇ ＡＲＢ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ，７ ＢＭＣ ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ２４０（２００６）；
Ｙａｄｈｕ Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｅｎｔｉｔｌｅｄ Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｂｅ Ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｕｓｉｎｇ ＡＲＢ Ｓｏｆｔｗａｒｅ．]
[0033] 以下の文献は、１６ＳｒＲＮＡのプローブおよびプライマーに関する。
Ｋ． Ｇｒｅｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲＰｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ １６Ｓ ｒＲＮＡ Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｍｏｓｔ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｆｏｕｎｄ ｉｎ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ，３２（２）Ｊ．ＣＬＩＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．３３５−３５１（１９９４）；
Ｐｈｉｌｉｐ Ｈｕｇｅｎｈｏｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，１７９ ＭＥＴＨＯＤＳ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．２９−４２（２００２）；
Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｌａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｐｒｏｂｅｓ ｔｏ ｅｎｕｍｅｒａｔｅ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｅｐｔｕｍ ｓｕｂｇｒｏｕｐ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｆａｅｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ，７（７）ＥＮＶＩＲＯＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．９３３−９４６（２００５）．]
[0034] ヌクレアーゼプロテクションアッセイは、核酸、特にＲＮＡを検出するために使用される、また別の方法である。ヌクレアーゼプロテクションアッセイで最も頻繁に使用されるのは、通常、ＤＮＡ基質またはＲＮＡ基質のいずれかに対して特異的に一本鎖のヌクレオチド配列を分解するヌクレアーゼである。これらのヌクレアーゼは一般に、それぞれの基質核酸の二本鎖形態やキメラ二本鎖核酸、すなわちＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡからなる二本鎖に対しては、活性が相当低下しているか、あるいはまったく活性を示さない。特に、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイは、転写産物、エキソン／イントロン境界等を含むＲＮＡ種の同定および特性決定を可能にする。リボヌクレアーゼプロテクションアッセイは通常、ＲＮＡプローブと標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーション、およびＲＮａｓｅ（通常ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ｉ、またはこれらのＲＮａｓｅの組み合わせ）の作用による、ハイブリダイズされていないＲＮＡの分解に依存する。反応としては、プローブＲＮＡとその標的ＲＮＡとを混合し、次いで熱変性、さらにはアニーリングを行うことによって、二本鎖ＲＮＡ複合体を生成する。このプローブ／標的複合体をＲＮａｓｅで処理し、試料中のハイブリダイズされていない断片、ハイブリダイズされていないプローブ、その他のＲＮＡ分子をすべて分解する。一般に、分解されていないプローブ／標的ＲＮＡ二本鎖断片だけがヌクレアーゼによる分解を免れ、次いで検出により分析される。]
[0035] これらの分野で多くの研究活動が行われているにもかかわらず、動植物および微生物の様々な組織のような多くの異なる試料からＤＮＡまたはＲＮＡを単離・検出するための方法は、最先端の実験室、高価な装置、および信頼できる仕事を行うために十分に訓練され、高度な教育を受けた人員を必要とすることが多い。このような方法はまた、サンガー法、ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＦＩＳＨ、アレイハイブリダイゼーション等の、最先端の主観的分析技術を必要とする。]
[0036] さらに、核酸を単離および／または検出するためには、高精製されたトータル核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡと共に、温度条件および時間条件の注意深くかつ正確な管理が必要とされることが多い。全体として考えると、核酸の単離および分析にかかる時間は長く、通常、開始から終了まで３〜６時間を要する。実際、アレイベースの方法では、一晩かけてハイブリダイゼーションを行うことも珍しくはない。さらに、洗浄が必要な場合、特にハイブリダイゼーション分析においては、ストリンジェンシーを得るために、一般的には厳密な温度管理が行われる。]
[0037] どのような分析においても、バックグラウンドシグナルおよび非特異的シグナルは擬似シグナルの一因となり、分析感度に内在的限界を課す可能性がある。そのため、分析におけるバックグラウンドシグナルを克服・低減するために、多くの試薬および技術が開発されている。しかし、非特異的発生源から生じるシグナルを低減するためには、さらなる改良を行う必要性がある。これは、分析系毎に、バックグラウンドシグナルまたは非特異的シグナルの要因となる特性があり、既存の方法ではこの問題に適切に対処することができないからである。免疫測定や核酸ハイブリダイゼーションのような既存の方法は、バックグラウンドシグナルおよび／または非特異的シグナルの低減による感度の改善がもたらす恩恵を受けることができる。]
[0038] したがって、使いやすく感度の高い分析だけでなく、改良された単離方法、ハイブリダイゼーション試薬、それらの方法のための条件、および核酸プローブとして使用できるオリゴヌクレオチドを用いたより使いやすく感度の高い分析もまた必要とされている。さらに、最先端の機器、高度に精製された核酸、高度な教育を受けた人員を使用しなくてもよい分析、およびそのような分析を行うための設備が必要とされている。さらに詳しくは、研究・診断に用いるプローブおよび分析、ならびに一般的に人および／または動物に接触し、食品、廃水、医薬品、パーソナルケア製品、および環境において見いだされることの多い微生物を検出するためのプローブおよび分析が必要とされている。]
[0039] 本発明は、核酸プローブと標的核酸との存在下で少なくとも１つのヌクレアーゼを使用すると、このプローブと標的核酸とが検出可能なプローブ−標的複合体を容易に形成するという知見に関する。一方、ヌクレアーゼが存在しない場合には、検出可能なプローブ−標的複合体は形成されない。この場合の複合体は、ヌクレアーゼの存在下で形成される複合体よりも相当遅い速度で形成されたり、複合体を形成するために温度と溶媒に関して厳密に定められた条件を使用することが必要とされることもある。さらに、ある種のフッ素界面活性剤が、分析成分の非特異結合から生じる（バックグラウンド）シグナルを低減させ得ることがわかった。この低減によって、特に非常に感度の高い分析、たとえば検出方法として化学発光を使用するもの等において、分析感度を上げることができる。これらの知見の一方または両方を使用することにより、核酸ハイブリダイゼーション分析を改善することができる。これらの実施形態のうちいくつかについて、以下でより詳細に説明する。]
[0040] 本発明は、試料中に存在する少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を検出する方法であって、
少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を含む可能性のある試料を提供すること、
該試料すなわち該目的配列と、
検出可能な標識で標識した少なくとも１つの核酸プローブと、
目的配列を分解することができるヌクレアーゼと
を、ヌクレアーゼをプローブよりも前またはプローブと同時に試料すなわち目的配列に加えて混合することにより混合物を作製し、
これによって目的配列とプローブとの複合体を形成させること、および
その存在が目的配列の存在を意味する、複合体中の該検出可能な標識のレベルを測定すること
を含む方法に関する。]
[0041] 本発明はまた、試料中に存在する少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を検出する方法であって、
少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を含む可能性のある試料を提供すること、
該試料すなわち該目的配列と、
検出可能な標識で標識した少なくとも１つの核酸プローブと目的配列を分解することができるヌクレアーゼとの混合物と
を混合して混合物を作製し、
これによって目的配列とプローブとの複合体を形成させること、および
その存在が目的配列の存在を意味する、複合体中の該検出可能な標識のレベルを測定すること
を含む方法に関する。]
[0042] 本発明はさらに、試料中に存在する少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を検出する方法であって、
少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を含む可能性のある試料を提供すること、
該試料すなわち該目的配列と、
検出可能な標識で標識した少なくとも１つの核酸プローブと、
目的配列を分解することができるヌクレアーゼと
を、プローブを選択した時間内に試料すなわち目的配列に加えて混合することにより混合物を作製し、
これによって目的配列とプローブとの複合体を形成させること、および
その存在が目的配列の存在を意味する、複合体中の該検出可能な標識のレベルを測定すること
を含む方法に関する。]
[0043] 本発明はまた、試料中に存在する少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を検出する方法であって、
少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を含む可能性のある試料を提供すること、
該試料すなわち該目的配列と、
検出可能な標識で標識した少なくとも１つの核酸プローブと、
目的配列を分解することができるヌクレアーゼと
を、目的配列がプローブにハイブリダイズするよりも前に、ヌクレアーゼを試料すなわち目的配列とプローブとに加えて混合することにより混合物を作製し、選択したパーセンテージでハイブリダイズさせ、
これによって目的配列とプローブとの複合体を形成させること、および
その存在が目的配列の存在を意味する、複合体中の該検出可能な標識のレベルを測定すること
を含む方法に関する。]
[0044] 本発明は、試料中に存在する少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を検出する方法であって、
少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を含む可能性のある試料を提供すること、
該試料すなわち該目的配列と、
検出可能な標識で標識した少なくとも１つの核酸プローブと、
目的配列を分解することができるヌクレアーゼと、
少なくとも１つのフッ素界面活性剤と
を混合して混合物を作製し、
これによって目的配列とプローブとの複合体を形成させること、および
その存在が目的配列の存在を意味する、複合体中の該検出可能な標識のレベルを測定すること
を含む方法に関する。]
[0045] 本発明はまた、試料中に存在する少なくとも１つのヌクレオチド配列を検出するためのキットであって、
検出可能な標識で標識した少なくとも１つのヌクレオチドプローブ、
フッ素界面活性剤、および
目的のヌクレオチド配列を分解することができるヌクレアーゼ
を含むキットに関する。]
[0046] 本発明のキットは、使用説明書をさらに含んでもよい。本キットはさらに試薬基質を含んでもよい。本キットはさらに溶解／抽出緩衝液、および／または洗浄緩衝液を含んでもよい。さらに、本発明のキットは、試料中に存在する少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を検出するためのどのような方法に使用してもよい。]
[0047] 本発明はまた、試料中に存在する目的とする標的を検出する方法であって、
目的とする標的を含む可能性のある試料を提供すること、
該試料すなわち該目的とする標的と、
検出可能な標識で標識した少なくとも１つのプローブと、
少なくとも１つのフッ素界面活性剤と
を混合して混合物を作製し、
これによって目的とする標的とプローブとの複合体を形成させること、および
その存在が目的とする標的の存在を意味する、複合体中の該検出可能な標識のレベルを測定すること
を含む方法に関する。
目的とする標的は、タンパク質、ペプチド、小型化学分子（ｓｍａｌｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、炭水化物、リポ多糖類、多糖および脂質からなる群から選ばれてもよい。]
[0048] 本発明はさらに、アプリケーションにおける非特異結合を低減させる方法であって、
少なくとも１つのフッ素界面活性剤を緩衝液に加えること、および
アプリケーションを実行することを含み、
該少なくとも１つのフッ素界面活性剤の存在によって、表面への非特異結合が低減することを特徴とする方法に関する。
上記アプリケーションは、免疫測定、マイクロ流体分析、ベッセル表面の不動態化、細胞培養または組織培養であってもよいが、これらに限定されない。]
[0049] 本発明は、試料であるＲＮＡ（ＲＮＡが標的である場合）および少なくとも１つの核酸プローブの存在下において、酵素であるＲＮａｓｅＡまたは他のヌクレアーゼを同時に使用することにより、核酸の精製および単離が不要になるという長所を持つ。さらに、試料としてトータル核酸が使用され、ＤＮＡが標的である場合、非特異結合の低減を補助するためにＲＮａｓｅ Ａを使用してもよい。さらに、プローブがそれぞれの標的へ到達しやすくなるように、ＲＮａｓｅ Ａまたは他のヌクレアーゼを使用することは新規であるだけでなく、ＦＩＳＨまたはマイクロアレイ分析等の他のプロトコルに適用することも可能である。さらに、本発明の分析は、熱やカオトロピック塩等の核酸を変性させる要素（核酸を単離するために通常必要とされる）も、ＲＮＡを分析する前または分析中における試料中ＲＮＡの変性も必要としない。ヌクレアーゼとして、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ ＩおよびＳ１ヌクレアーゼを使用してもよい。]
[0050] 本発明はさらに、試料中に存在する目的ヌクレオチド配列を検出する方法であって、
分析の対象となる目的ヌクレオチド配列を含む可能性のある試料を提供するステップ、
該試料からヌクレオチド配列を抽出するステップ、
抽出した目的ヌクレオチド配列を、少なくとも１つの核酸プローブとともにハイブリダイゼーション条件下でインキュベートし、これによって検出可能な標識で標識された少なくとも１つの核酸プローブが抽出した目的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、目的物−プローブ複合体のヌクレオチド配列を形成するステップ、
目的物−プローブ複合体のヌクレオチド配列を洗浄するステップ、
目的物−プローブ複合体のヌクレオチド配列に試薬基質を加えるステップ、および
その検出が目的ヌクレオチド配列の存在を意味する、該検出可能な標識によってハイブリダイゼーションのレベルを測定するステップ
を含む方法に関する。]
[0051] 本発明の別の実施形態は、グラム陰性菌をグラム陽性菌から識別する方法であって、
分析の対象となる目的核酸配列を含む微生物を含む可能性のある試料を提供するステップ、
該微生物を溶解するステップ、
該微生物から目的ヌクレオチド配列を抽出するステップ、
抽出した目的ヌクレオチド配列を、少なくとも１つの核酸プローブとともにハイブリダイゼーション条件下でインキュベートし、これによって検出可能な標識で標識された少なくとも１つの核酸プローブが抽出した目的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、目的物−プローブ複合体のヌクレオチド配列を形成するステップ、
目的物−プローブ複合体のヌクレオチド配列を洗浄液で洗浄するステップ、
洗浄した目的物−プローブ複合体のヌクレオチド配列に試薬基質を加えるステップ、および
その検出がグラム陰性菌の存在を意味する、該検出可能な標識によってハイブリダイゼーションのレベルを測定するステップ
を含む方法に関する。]
[0052] 本発明はさらに、試料中に存在する核酸を検出する方法であって、
分析の対象となるＲＮＡを含む可能性のある細胞試料を提供するステップ、
該細胞を溶解するステップ、
該細胞からＲＮＡを抽出するステップ、
抽出したＲＮＡを、少なくとも１つの核酸プローブとともにハイブリダイゼーション条件下でインキュベートし、これによって検出可能な標識で標識された少なくとも１つの核酸プローブが抽出したＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ−プローブ複合体を形成するステップ、
ＲＮＡ−プローブ複合体を洗浄液で洗浄するステップ、
洗浄したＲＮＡ−プローブ複合体に試薬基質を加えるステップ、および
その検出がＲＮＡの存在を意味し該ＲＮＡにより細胞同定ができる、該検出可能な標識によってハイブリダイゼーションのレベルを測定するステップ
を含む方法に関する。
さらに、この進歩的な分析法により、細菌、真菌または他の微生物等の微生物を検出してもよい。]
[0053] 本発明の別の実施形態は、グラム陰性菌をグラム陽性菌から識別する方法であって、
分析の対象となるＲＮＡを含む微生物を含む可能性のある試料を提供するステップ、
該微生物を溶解するステップ、
該微生物からＲＮＡを抽出するステップ、
抽出したＲＮＡを、少なくとも１つの核酸プローブとともにハイブリダイゼーション条件下でインキュベートし、これによって検出可能な標識で標識された少なくとも１つの核酸プローブが抽出したＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ−プローブ複合体を形成するステップ、
ＲＮＡ−プローブ複合体を洗浄液で洗浄するステップ、
洗浄したＲＮＡ−プローブ複合体に試薬基質を加えるステップ、および
その検出がグラム陰性菌の存在を意味する、該検出可能な標識によってハイブリダイゼーションのレベルを測定するステップ
を含む方法に関する。]
[0054] 本発明はさらに、試料中に存在する微生物を検出する方法であって、
分析の対象となるＤＮＡを含む微生物を含む可能性のある試料を提供するステップ、
該微生物を溶解するステップ、
該微生物からＤＮＡを抽出するステップ、
抽出したＤＮＡを、少なくとも１つの核酸プローブとともにハイブリダイゼーション条件下でインキュベートし、これによって検出可能な標識で標識された少なくとも１つの核酸プローブが抽出したＤＮＡにハイブリダイズし、ＤＮＡ−プローブ複合体を形成するステップ、
ＤＮＡ−プローブ複合体を洗浄液で洗浄するステップ、
洗浄したＤＮＡ−プローブ複合体に試薬基質を加えるステップ、および
その検出が微生物の存在を意味する、該検出可能な標識によってハイブリダイゼーションのレベルを測定するステップ
を含む方法に関する。]
[0055] 本発明の別の実施形態は、グラム陰性菌をグラム陽性菌から識別する方法であって、
分析の対象となるＤＮＡを含む微生物を含む可能性のある試料を提供するステップ、
該微生物を溶解するステップ、
該微生物からＤＮＡを抽出するステップ、
抽出したＤＮＡを、少なくとも１つの核酸プローブとともにハイブリダイゼーション条件下でインキュベートし、これによって検出可能な標識で標識された少なくとも１つの核酸プローブが抽出したＤＮＡにハイブリダイズし、ＤＮＡ−プローブ複合体を形成するステップ、
ＤＮＡ−プローブ複合体を洗浄液で洗浄するステップ、
洗浄したＤＮＡ−プローブ複合体に試薬基質を加えるステップ、および
その検出がグラム陰性菌の存在を意味する、該検出可能な標識によってハイブリダイゼーションのレベルを測定するステップ
を含む方法に関する。]
[0056] 本発明の分析に少なくとも１つのフッ素界面活性剤を使用してもよい。ゾニール（登録商標）ＦＳＡ等のフッ素界面活性剤を使用することは新規であり、これを使用することにより試料中の非特異結合および発泡が低減される。さらに、本発明の新規かつ有利な特徴として、本分析に使用されるプローブおよびそれらの組み合わせ（単一プローブ、デュアルプローブおよびトリプルプローブを使用してもよい）、ハイブリダイゼーション時間が比較的短いこと、ハイブリダイゼーションステップと捕捉ステップとの間で洗浄が不要であること、同様の結果が得られるハイブリダイゼーション温度および捕捉温度の範囲が広いこと（すなわち、約２０〜４２℃、または最高約５５℃まで）、および非ストリンジェントな洗浄ステップが挙げられる。]
[0057] 本発明で使用される少なくとも１つのフッ素界面活性剤は、陰イオンフッ素界面活性剤、陽イオンフッ素界面活性剤、両性（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ）フッ素界面活性剤、非イオンフッ素界面活性剤、両性イオン（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ）フッ素界面活性剤、およびそれらの混合物からなる群から選んでよい。上記少なくとも１つのフッ素界面活性剤は、３−［２−（パーフルオロアルキル）エチルチオ］プロピオン酸のカルボン酸リチウム塩、リン酸アンモニウムビス［２−（パーフルオロアルキル）エチル］、鎖長が４未満のパーフルオロアルコール、フルオロ脂肪族リン酸エステルアンモニウム、またはそれらの混合物であってもよい。]
[0058] 本発明の方法において、必要に応じ、インキュベートする前に少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を試料から抽出してもよい。この抽出は、溶解／抽出緩衝液とともに試料をインキュベートすることにより行うことができる。]
[0059] 本発明の方法において、１、２または３つ以上の核酸プローブを使用してもよい。このプローブは、捕捉プローブおよびシグナルプローブの両方の機能を持つ単一プローブでもよく、一方が捕捉プローブであり他方がシグナルプローブである２つのプローブであってもよい。また、捕捉プローブ、シグナルプローブおよびブリッジプローブの３つのプローブを含むプローブ系も考えられる。捕捉プローブおよびシグナルプローブは検出可能な標識で標識することができ、そこに試薬基質が加えられる。]
[0060] 捕捉プローブの標識としてビオチンが挙げられ、シグナルプローブの標識としてアルカリホスファターゼが挙げられる。アルカリホスファターゼは、アダマンチル−１，２−ジオキセタンリン酸、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウム、およびパラニトロフェニルリン酸からなる群から選ばれる試薬基質と反応する。]
[0061] 本発明の方法は、液相ハイブリダイゼーションを含んでもよく、次いで所望の核酸が捕捉され、さらに洗浄が行われる。ハイブリダイゼーションステップは、液相ハイブリダイゼーションまたは固相支持体上でのハイブリダイゼーションのいずれかで実施することができる。あるいは、液相ハイブリダイゼーションおよび固相支持体上でのハイブリダイゼーションの両方を利用したハイブリダイゼーション系で実施することもできる。]
[0062] 本発明の方法は、検出可能な標識によってハイブリダイゼーションレベルを測定する前に、複合体を固定化すること、非結合物質を除去するために洗浄緩衝液で複合体を洗浄すること、および複合体を保持することを含んでもよい。あるいは、複合体を固定化して、洗浄を省くこともできる。本発明の方法が洗浄ステップを含む場合、洗浄後に試薬基質を加えることをさらに含んでもよい。]
[0063] 本発明の方法は、微生物、細菌、ならびに酵母および糸状菌等の真菌を含むがこれらに限定されない、あらゆるタイプの試料からのＤＮＡおよびＲＮＡの検出に有用である。さらに、本発明の方法は、核酸以外の目的とする標的を検出するために使用することもできる。たとえば、この方法を、タンパク質、ペプチド、小型化学分子（ｓｍａｌｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、炭水化物、リポ多糖、多糖、および脂質を検出するために使用することができる。また、この方法を、免疫測定、マイクロ流体分析、細胞培養およびベッセル表面の不動態化等のアプリケーションにおいて、非特異結合を低減させるために使用することもできる。]
[0064] 当業者は、以下の図および詳細な説明を参照することによって、本発明の他の系、方法、特徴および利点を理解するだろう。このようなさらなる系、方法、特徴および利点はすべて本明細書に包含され、本発明の範囲内であり、請求項によって保護される。]
[0065] 本明細書に組み込まれ、かつ本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の実施形態を例証し、詳細な説明とともに本発明の利点および原理を説明するものである。]
図面の簡単な説明

[0066] 大腸菌が有するリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の小サブユニットの二次構造を示す図である。]
[0067] 用語の説明]
[0068] 以下の用語は、別途明確に述べられない限り、本明細書中で使用されているような以下の特定の意味を有する。]
[0069] 「ヌクレオチド」とは、リン酸基、五炭糖および窒素含有塩基からなる、核酸のサブユニットである。ＲＮＡに存在する五炭糖はリボースである。ＤＮＡに存在する五炭糖は２−デオキシリボースである。５’−ヌクレオチドは、五炭糖の５’位の炭素に水酸基（−ＯＨ）を含む。ヌクレオチドには、このようなサブユニットの類似体、特に、リボースの２’位にメトキシ基（−ＯＭｅ）を有する類似体も含まれる。本明細書中では、「Ｔ」残基を含むメトキシオリゴヌクレオチドは、リボース部分の２’位にメトキシ基を有し、そのヌクレオチドの塩基位置にウラシルを有する。]
[0070] 「オリゴヌクレオチド」とは、２つ以上のヌクレオチドサブユニットが互いに共有結合したヌクレオチド重合体である。オリゴヌクレオチドは、通常約１０〜１００ヌクレオチド長である。このヌクレオチドサブユニットの糖群は、リボース、デオキシリボース、またはＯＭｅ基等で修飾されたこれらの修飾誘導体であってもよい。このヌクレオチドサブユニットは、リン酸ジエステル結合、修飾結合等の結合、またはオリゴヌクレオチドがその相補的な標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズすることを阻害しない非ヌクレオチド部分によって結合されてもよい。修飾結合は、通常のリン酸ジエステル結合が、ホスホロチオエート結合、メチルホスホン酸結合、および中性のペプチド結合のような別の結合と置き換わったものを含む。さらに、本発明よれば、オリゴヌクレオチドの構成成分は、窒素含有塩基の類似体でもよい。]
[0071] 「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」または「標的配列」は、オリゴヌクレオチドによってハイブリダイズされる、特定のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列である。]
[0072] 「ヌクレオチドプローブ」とは、標的核酸配列に対して十分に相補的なヌクレオチド配列を有し、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で検出可能なハイブリッドであるプローブ：標的の二本鎖を形成することができるヌクレオチドである。ヌクレオチドプローブは単離された化学種であり、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションを阻害しない限り、標的領域外に付加的なヌクレオチドを含んでもよい。本発明のプローブを使用した検出を容易にするために、プロモーター配列や制限酵素認識部位、または触媒活性部位のような所望の二次構造・三次構造を付与する配列等の非相補的配列を使用してもよい。ヌクレオチドプローブは、放射性同位元素、蛍光部分、化学発光部分、色素産生部分、酵素またはリガンド等の検出可能な部分で任意に標識してもよく、これらの検出可能な成分によって標的配列へのプローブハイブリダイゼーションを検出または確認でき、あるいは配列の同定が可能となる。さらに、ヌクレオチドプローブはヌクレオチド類似体を含んでもよい。ヌクレオチド類似体プローブは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ホスホチオエート含有プローブ、ロックされた核酸（ＬＮＡ）プローブ、および２’−Ｏ−メチル残基含有核酸プローブを含む。ヌクレオチドプローブは、１０〜１００ヌクレオチド長の範囲であることが好ましい。]
[0073] 「シグナルプローブ」は、検出可能な標識を含む。シグナルプローブは、目的試料中に存在する標的核酸内の標的セグメントと選択的にハイブリダイズすることができ、通常１５〜１００、しばしば３０〜７０、好ましくは１５〜２９の標的核酸内の標的セグメントと選択的にハイブリダイズできるヌクレオチドで構成される。]
[0074] 「捕捉プローブ」は、金ナノ粒子、常磁性微粒子、マイクロタイタープレートのウェルの表面、プラスチック製のチューブ壁、または固体相がたとえば化合物で被覆されているメンブレン等の固体表面に結合することができる。この被覆する化合物は、たとえば、アビジンまたはストレプトアビジンでよく、この場合、捕捉プローブはビオチン化される。さらに、捕捉プローブは、目的試料中に存在する標的核酸内の標的セグメントと選択的にハイブリダイズすることができ、通常１５〜１００、しばしば３０〜７０のヌクレオチドで構成されるが、１５〜２９のヌクレオチドで構成されることが好ましい。]
[0075] 「ブリッジプローブ」は、通常標識されず、目的試料中に存在する標的核酸内の標的セグメントと選択的にハイブリダイズすることができる。ブリッジプローブは、通常１５〜１００、しばしば３０〜７０のヌクレオチドで構成されるが、１０〜２９のヌクレオチドで構成されることが好ましい。ブリッジプローブは、通常、本分析において使用するＲＮａｓｅＡによる分解から標的ｒＲＮＡのセグメントを保護する。]
[0076] さらに、プローブは、捕捉プローブおよびシグナルプローブの両方に属する単一プローブ、一方が捕捉プローブであり他方がシグナルプローブである２つのプローブを含む系、ならびに捕捉プローブ、シグナルプローブ、およびブリッジプローブの３つのプローブを含む系を含んでもよい。]
[0077] 絶対的な識別能、つまり標的核酸に対する特異的結合性を有する必要があるのは、これらのプローブのうち１つのみである。すなわち、シグナルプローブ、捕捉プローブのうち少なくともいずれか１つは、ハイブリダイゼーションにおいて、標的核酸の選択された標的セグメントに対する識別能を有するべきである。単一プローブ分析では、シグナルプローブを使用することができる。デュアルプローブ分析では、捕捉プローブおよびシグナルプローブを使用することができる。トリプルプローブ分析では、シグナルプローブ、捕捉プローブ、およびブリッジプローブを使用することができる。実際には、シグナルプローブのハイブリダイゼーションセグメントおよび捕捉プローブのハイブリダイゼーションセグメントは互いに代用でき、どちらもほぼ同様にグラム陰性菌をグラム陽性菌から識別できる。２つ以上のプローブセットを分析で使用する場合、通常、これらは標的核酸の隣接したセグメントにハイブリダイズする。しかしながら、標的核酸内のそれぞれの標的セグメントにこれらのプローブがハイブリダイズするとき、それぞれのプローブの末端と末端との間に小さな隙間が存在してもよい。この隙間は、通常１０〜２０ヌクレオチド長、より一般的には５〜１０ヌクレオチド長、好ましくは０〜３ヌクレオチド長である。プローブ設計のための手順およびソフトウェアは当技術分野でよく知られており、一般的に使用されるリソースとして、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）およびｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＥＭＢＬ）のような核酸データベース、ならびにｔｈｅ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ）およびｔｈｅ ＡＲＢ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＡＲＢ）のようなソフトウェアが挙げられる。]
[0078] 「検出可能な部分」とは、核酸プローブに付着させたか、もしくはその一部として合成された分子である。この分子は、一意的に検出可能であるべきであり、この検出によってプローブを検出することができる。これらの検出可能な成分は、放射性同位元素、蛍光分子、化学発光分子、色素産生酵素、ハプテン、または特徴的なオリゴヌクレオチド配列であることが多い。]
[0079] 「ハイブリッド」または「二本鎖」とは、相補塩基間のワトソン・クリック型塩基対合または非標準塩基対合によって、２本の一本鎖核酸配列から形成された複合体である。]
[0080] 「ハイブリダイゼーション」とは、２本の核酸相補鎖が結合して、二本鎖構造（「ハイブリッド」すなわち「二本鎖」）を形成することである。]
[0081] 「相補性」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖上の塩基配列が、ワトソン・クリック型塩基対間の水素結合によって、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、またはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドすなわち二本鎖を形成する可能性を有する特性である。アデニン（Ａ）は通常チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）に相補的であり、グアニン（Ｇ）は通常シトシン（Ｃ）に相補的である。]
[0082] 「ミスマッチ」とは、ハイブリッド内に存在する、標準的なワトソン・クリック型水素結合を形成しない２つのヌクレオチドからなるあらゆる対合である。さらに、以下の説明では、ミスマッチは、ハイブリッドのうち１本の鎖において挿入または欠失が起こった結果、対をなさなくなったヌクレオチドをも含む。]
[0083] 「ストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーションおよびそれに続く処理ステップにおける、温度および溶媒組成を説明するために使用される。高ストリンジェンシー条件下では、相補性の高い核酸ハイブリッドだけが形成され、十分な相補性がなければハイブリッドは形成されない。したがって、分析条件におけるストリンジェンシーによって、ハイブリッドを形成する２本の核酸鎖間で必要とされる相補性の度合いが決まる。ストリンジェンシー条件は、標的核酸との結合で形成されるハイブリッドの安定性と、非標的核酸との結合で形成されるハイブリッドの安定性との差が最大になるように選択される。典型的なストリンジェンシー条件は、以下の実施例で提示される。]
[0084] 「プローブの特異性」とは、標的配列と非標的配列とを識別するプローブの能力特性である。]
[0085] 「細菌」は、主要な三界のうちの１つと考えられている、真正細菌系統群に属する。]
[0086] 「Ｔｍ」とは、プローブの５０％がハイブリダイズされた状態からハイブリダイズされていない状態に変化する温度である。]
[0087] 「抽出されたＲＮＡ」とは、Ａ２６０／Ａ２８０比が１．８未満のＲＮＡである。]
[0088] 「抽出されたＤＮＡ」とは、Ａ２６０／Ａ２８０比が１．８未満のＤＮＡである。]
[0089] 「トータル核酸」とは、Ａ２６０／Ａ２８０比が１．８未満のトータル核酸である。精製された状態では、上記３種の核酸それぞれのＡ２６０／Ａ２８０比は、少なくとも１．８、通常１．８〜２．２である。]
[0090] 当業者は、本発明と実質的に同一であるプローブが、本明細書記載の配列とは異なっている場合もあり、それでもなお同一の標的核酸配列とハイブリダイズすることを理解するだろう。記載の核酸配列との差異は、その配列内に存在する記載の配列と同一の塩基のパーセンテージで表してもよく、またそのプローブと標的配列との間で完全に相補的な塩基のパーセンテージで表してもよい。これらのパーセンテージが１００〜８０％、または１０ヌクレオチド標的配列中の０〜２塩基がミスマッチである場合、本発明のプローブは実質的に核酸配列に相当する。一実施形態においては、このパーセンテージは１００〜８５％である。別の実施形態においては、このパーセンテージは９０〜１００％である。また別の実施形態においては、このパーセンテージは９５〜１００％である。]
[0091] 「十分に相補的」または「実質的に相補的」とは、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、検出できる安定なハイブリッドを形成するに足る、十分な量の隣接した相補的ヌクレオチドを核酸が有することである。]
[0092] 「核酸ハイブリッド」または「プローブ：標的二本鎖」とは、水素結合による二本鎖構造であり、好ましくは１０〜１００ヌクレオチド長、より好ましくは１４〜５０ヌクレオチド長である。この構造は、化学発光検出、生物発光検出、蛍光検出、オートラジオグラフィー、電気化学分析、ゲル電気泳動等の手段を用いた検出において十分に安定である。このようなハイブリッドは、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはＤＮＡ：ＤＮＡからなる二本鎖分子、およびＰＮＡ等の類似体を含む。]
[0093] 「選択的にハイブリダイズする」とは、適切なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下において、オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸とハイブリダイズし、安定したプローブ：非標的ハイブリッド（他の生物に由来する非標的核酸の存在を示す）を形成することなく、安定したプローブ：標的ハイブリッド（標的核酸の存在を示す）を形成することである。このように、プローブが非標的核酸と比べて十分に多くの標的核酸とハイブリダイズすることにより、当業者は、たとえば、腸内細菌科のようなグラム陰性菌の存在を正確に検出し、それらの存在と他の生物の存在とを正確に識別することができる。選択的ハイブリダイゼーションは、当技術分野で公知の技術を用いて測定してもよく、その技術は本明細書に記載されている。たとえば、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）（酵母の一種）の核酸とのハイブリダイゼーションと比較して、腸内細菌科細菌の核酸を約５０〜７，０００倍選択的にハイブリダイズする。当業者は、特定の状況に応じて、具体的なストリンジェンシー条件またはその範囲を決定することができるだろう。すなわち、ストリンジェンシーは、実施する分析法、核酸のソース、使用するプローブ等に基づいて決定することができるが、これらの制限を受けない。]
[0094] 腸内細菌科の「標的核酸配列領域」とは、他の種の核酸中には存在しないが、腸内細菌科細菌の核酸中に存在する核酸配列またはそれに相補的な配列である。標的を増幅することによって、標的配列に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸を作製してもよい。]
[0095] 「少なくとも１つの核酸プローブ」とは、１つ以上の核酸プローブである。この核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＰＮＡ等のヌクレオチド類似体であってもよい。]
[0096] 「同時に」とは、すべての分析成分を同時にインキュベートすることである。より具体的には、すべての成分は反応ベッセルに同時に加えられ、これによって必要とされる成分すべてが反応全体にわたって存在することになる。]
[0097] ＲＮＡ一本鎖は通常高いコピー数となり、ある種のウイルスを除いては生細胞の代用となるため、ＤＮＡへのハイブリダイゼーションよりも、ＲＮＡ、特にｒＲＮＡへのハイブリダイゼーションが好ましい。ｒＲＮＡは一本鎖の分子ではあるが、通常とは異なる二次構造・三次構造をとっているため、プローブが特定のセグメントに到達することは極めて困難である。微生物を検出する分析においてｒＲＮＡをうまく使用するためには、二次構造・三次構造を破壊しなければならないが、ハイブリダイゼーションが起こる程度にとどめなければならない。ｒＲＮＡを溶液中で変性させたとしても、スナップバックして二次構造・三次構造を再構成しようとする傾向を示す可能性がある。このスナップバックは、拡散律速ではない、分子内のリフォールディングにより急速に生じる。さらに、ｒＲＮＡ分子が広範囲に分解されていないことを確認しなければならない。とは言うものの、ｒＲＮＡは、その配列情報の濃さおよび幅広さ、ならびに生細胞内に存在することおよびその豊富さに起因して、生物の識別を可能にする潜在能力を持つため、格好の標的となる。]
[0098] 驚くべきことにかつ予想外に、出願人らは、本発明を使用する技術者が微生物の検出分析および／または同定分析を簡単に手早く実施できる分析条件およびプロトコルを発見した。この条件は、フッ素界面活性剤等の試薬を使用することを含む。フッ素界面活性剤、すなわちフッ素で処理された界面活性剤は、類似の炭化水素系界面活性剤と比べて、水の表面張力をより効果的に低下させるフッ化炭素系界面活性剤である。本明細書において、フッ素界面活性剤は、分子内のフッ化炭素単位、フッ化炭素エンティティ、フッ化炭素基またはフッ化炭素セグメント部分に、全体として６つ以上のフッ素を有してもよい。]
[0099] フッ素界面活性剤としては、デュポン社製のゾニール界面活性剤が挙げられるが、これに限定されない。この化合物はフッ素界面活性剤類および単量体類に属する。ゾニールＦＳＡは、３−［２−（パーフルオロアルキル）エチルチオ］プロピオン酸のカルボン酸リチウム塩であり、ＲｆＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＬｉで表される。ゾニールＦＳＥは、上記ゾニールＦＳＡと同様の特性を持つ別の好適なフッ素界面活性剤であり、リン酸アンモニウムビス［２−（パーフルオロアルキル）エチル］として知られており、（ＲｆＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＰＯ（ＯＮＨ４）ｙ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）３−ｘ−ｙで表される。さらに、（ＲｆＣＨ２ＣＨ２Ｏ）Ｐ（Ｏ）（ＯＮＨ４）２および（ＲｆＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２Ｐ（Ｏ）（ＯＮＨ４）の混合物である、フッ素界面活性剤のゾニールＦＳＰも本発明の分析に有用である。ゾニールを含む洗浄剤を使用すると、バックグラウンドシグナルが著しく低減され、技術者は、より明瞭で、かつ曖昧でない結果を得ることができる。さらに、ゾニール界面活性剤を使用することにより、分析中の試料の発泡も低減できる。他の有用なフッ素界面活性剤シリーズとして、セイミケミカル社製のサーフロン（登録商標）シリーズ、インペリアル・ケミカル・インダストリーズ製のＡｔｓｕｒｆ（登録商標）シリーズ、オムノバ・ソリューションズ製の鎖長が４未満のパーフルオロアルコールである、ＰｏｌｙＦｏｘ（登録商標）シリーズ、Ｍａｓｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ製のＭａｓｕｒｆ（登録商標）シリーズ等が挙げられる。]
[0100] 一般に、フッ素界面活性剤は、アルキル基、アリール基、およびアルキル基で置換されたアリール基を有し、全フッ素置換されたセグメントを含むフッ素界面活性剤から選ぶことができ、これらのフッ素界面活性剤は他の官能基も含むことができる。これらの官能基には、第一級、第二級、第三級、および第四級の、またはそれらの機能を有する、リン酸基、カルボン酸基およびアミン基が含まれるが、これらに限定されない。さらに、フッ素界面活性剤は、陰イオン性、陽イオン性、両性（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ）、非イオン性、および両性イオン性（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ）等の、フッ素界面活性剤の公知である主要な分類から選ぶことができる。本発明の分析で使用される可能性のあるフッ素界面活性剤として、具体的には、３−［２−（パーフルオロアルキル）エチルチオ］プロピオン酸のカルボン酸リチウム塩、リン酸アンモニウムビス［２−（パーフルオロアルキル）エチル］、鎖長が４未満のパーフルオロアルコール、フルオロ脂肪族リン酸エステルアンモニウム、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。]
[0101] 特に、反応種が、反応ｐＨにおいて正味の負電荷を有する被検体および活性試薬を含む場合、陰イオンフッ素界面活性剤が有用である。このような正味の負電荷には、ハイブリダイゼーション反応において核酸プローブおよび試料である核酸のリン酸塩主鎖によって生じるものが含まれる。ハイブリダイゼーション分析は、タンパク質相互作用を利用することも多い。たとえば、ストレプトアビジン／ビオチンまたはアビジン／ビオチンの相互作用を利用する場合、使用されるこれらのタンパク質が正電荷を有する可能性があり、これらのタンパク質と核酸との間で電荷相互作用を起こして、非特異結合を生じることがある。以下の実施例において説明されるように、陰イオンフッ素界面活性剤を使用することによってこのような相互作用を低減することができる。]
[0102] 重要なことには、フッ素界面活性剤を使用することによる有益な効果は、反応ｐＨにおいて主要な反応種が正味の正電荷を持つ、タンパク質に基づいた分析にも適用できる。たとえば、液相または固相の免疫測定において、核酸の代わりに、抗体等の反応成分を使用することができる。この場合、陽イオンフッ素界面活性剤を使用することにより、上記のような非特異相互作用およびバックグラウンドシグナルを低減することができる。核酸ハイブリダイゼーション分析およびタンパク質に基づいた分析の両方において、バックグラウンドおよび非特異結合を低減するために、陽イオン性、陰イオン性、および非イオン性のフッ素界面活性剤を使用することができ、特に、ポリスチレン、ポリカーボネート、ガラス、シリカ、酸化鉄、金属（たとえば、金）およびメンブレン（たとえば、硝酸セルロース、ＰＶＤＦ、酢酸セルロース等を含むメンブレン）等の表面とともにこれらを用いることができる。当業者は、分析成分として使用される有用なフッ素界面活性剤の望ましい物理的特性を正しく理解するだろう。このような物理的特性として、たとえば、所望の濃度におけるフッ素界面活性剤の水溶性、および他の分析成分を不活性化しないような、活性を有する生物学的成分（たとえば、抗体や酵素）との適合性が挙げられる。]
[0103] しかしながら、当業者が容易に判断できるように、フッ素界面活性剤を用いてプロテアーゼやヌクレアーゼ等の、いくつかの分析成分を不活性化することが望ましい場合がある。フッ素界面活性剤の種類および濃度は、分析に使用するｐＨ、塩類、緩衝剤、追加する洗浄剤、および他の分析成分に依存する。フッ素界面活性剤の濃度の有効範囲は、通常１〜０．０００１％である。場合によっては、たとえばメンブレンまたは他の固体表面を不動態化するために、フッ素界面活性剤を有機溶媒または水／有機溶液（たとえば、ＤＭＳＯやエタノール）に溶解してもよく、当業者は所望の適切な溶媒条件を正しく理解するだろう。フッ素界面活性剤は、分析のいくつかの時点で加えることができる。一実施形態では、フッ素界面活性剤を、他の成分（たとえば、ブロッキング剤としての成分、またはブロッキング剤とともに使用される成分）を混ぜ合わせる前に加えることができる。別の実施形態では、フッ素界面活性剤を、インキュベーションステップまたはハイブリダイゼーションステップにおいて加えることができる。また別の実施形態では、フッ素界面活性剤を洗浄ステップにおいて加えることができる。]
[0104] さらに、驚くべきことに、少量のＲＮａｓｅを使用することによって、ＲＮＡと核酸プローブとをより良くより完全にハイブリダイズさせることができる。ＲＮａｓｅを使用することによって、広範囲に構造を分解することなくＲＮＡの二次構造・三次構造を破壊することができ、これによってハイブリダイズが可能となる。最終的には大部分のｒＲＮＡが分解されてもよいが、この分解が試験結果に著しい影響を与えるものであってはならない。他のヌクレアーゼを使用してもよく、たとえば非特異的ヌクレアーゼおよびＤＮａｓｅが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、驚くべきことに、出願人らは、単一の分析用ベッセルを使用して、この進歩的な分析を実施できる可能性が高いことを発見した。]
[0105] 上記ヌクレアーゼは、複合体中の目的配列もプローブも実質的に分解しないヌクレアーゼである。反応ベッセルには、試料すなわち少なくとも１つの目的配列、検出可能な標識で標識された少なくとも１つのプローブ、およびヌクレアーゼを含む分析成分が加えられる。ヌクレアーゼを加えるタイミングは、他の反応成分との比較で言えば、目的配列およびプローブを加える前またはそれと同時であってよい。一実施形態では、ヌクレアーゼは目的配列およびプローブと同時に加えられる。]
[0106] プローブを加える前に、あまりにも早くヌクレアーゼを加えると、分析の対象となる試料中に存在する標的配列の分解が起こることがあるため、ハイブリダイゼーション反応混合物へヌクレアーゼを加えるタイミングは重要である。目的標的配列を含む可能性のある試料にヌクレアーゼを加えてから１つ以上の本分析の核酸プローブを加える場合、ヌクレアーゼを加えた直後から２、３分以内に、プローブを加えることが好ましい。ヌクレアーゼを加えることができる時間として選択されるのは、たとえば、約０〜６０分、約１〜３０分、約１〜１５分、約０〜５分、または約０〜２分である。これらの時間範囲は、プローブを加えた後にヌクレアーゼを加えるまでの時間を示し、ヌクレアーゼが活性を持つ温度またはその近辺の温度でヌクレアーゼが加えられる場合において重要になり得る。この温度は、中温性生物由来のヌクレアーゼの場合、約２０〜５０℃であり得る。室温よりもかなり高い温度でしか活性を持たない高温性ヌクレアーゼの一部は、室温以下では活性をほとんどまたはまったく示さない可能性があるが、ハイブリダイゼーション温度では適切な活性を持つため、プローブを加えるタイミングはそれほど重要ではない。]
[0107] ヌクレアーゼを加える別の態様として、ヌクレアーゼが活性を持たない条件下において任意の順で反応成分を加えることも可能である。この例では、他の分析成分の必要な機能を損なわずにヌクレアーゼを活性化するため、後から条件を変更することができる。たとえば、ヌクレアーゼが通常不活性である約４℃の反応温度において、各成分を加える場合、すべての成分をほぼ同時に加えることができる。これに引き続き、分析温度をハイブリダイゼーションに適した温度まで上げることによって、ヌクレアーゼが本来の完全な活性を取り戻し、ハイブリダイゼーション反応を進ませることができる。]
[0108] 条件を変更することによりヌクレアーゼの不活性化または活性化を容易に行うための別の実施形態として、金属イオンの添加が挙げられる。金属イオン（たとえば、カルシウムイオンまたは亜鉛イオン）は、本分析で使用されるどのようなヌクレアーゼをも阻害する。金属イオンおよびヌクレアーゼを考慮に入れた適切な濃度において、ヌクレアーゼに作用させるためこれらの金属イオンを緩衝液に加え、これによって可逆的にヌクレアーゼを不活性化する。本分析のハイブリダイゼーションのための成分は、１つ以上の核酸を含む可能性のある試料、１つ以上の核酸プローブ、および可逆的に不活性化されたヌクレアーゼを含む。ハイブリダイゼーション成分を構築した後、使用した金属イオンのキレート化剤を加えることによってヌクレアーゼを活性化する。たとえば、ヌクレアーゼを阻害するためにカルシウムイオンの塩化物を使用する場合、カルシウムをキレート化して実質的にヌクレアーゼへの阻害作用をなくすために、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡを使用することができる。カルシウムがキレート化されることによって、ヌクレアーゼが実質的にその完全な活性を取り戻し、これによってプローブと標的である可能性のあるものとのハイブリダイゼーション反応が容易となる。選択的かつ可逆的にヌクレアーゼを不活性化するこれらの方法によって、反応成分を構築することが容易となる。ハイスループットな処理を行う状況においてしばしばそうであるように、多数（たとえば、９６、３８４、または１５３６等）の試料を分析する必要がある場合にこれらの方法はとりわけ有用である。温度を利用する実施形態およびキレート化を利用する実施形態は、それぞれを単独で使用することも併用することもでき、あるいは本分析で使用されるヌクレアーゼを選択的かつ可逆的に阻害する他の組み合わせも使用することができる。]
[0109] ヌクレアーゼを選択的かつ可逆的に阻害する利点は、複数の分析試料におけるハイブリダイゼーション反応を同時に開始できることである。すべての試料においてヌクレアーゼをほぼ同時に活性化することができ、これによって本発明の分析の定量結果または定性結果を向上させることができる。これに対して、個々に構築された複数の反応系では、成分添加後のインキュベーション時間が最初に処理をした試料と最後に処理をした試料とで実質的に異なってくる。]
[0110] 本発明の分析は、液相ハイブリダイゼーションを含んでもよく、次いで所望の核酸が捕捉され、さらに洗浄ステップが実施される。これらのステップを含む場合、生物を検出する分析の大部分とは対照的に、初めのハイブリダイゼーション後および捕捉後の両方において洗浄ステップが必要となる。しかしながら、本発明のハイブリダイゼーションステップは、液相ハイブリダイゼーション、固相支持体を用いたハイブリダイゼーション、および液相ハイブリダイゼーションと固相支持体上でのハイブリダイゼーションとを両方用いるハイブリダイゼーション系のいずれでも行うことができる。]
[0111] 洗浄ステップが使用される場合、洗浄後の試料に試薬基質を加えることによって検出分析を行うことができる。一実施例において、１つの核酸プローブを使用する場合、該核酸プローブの一端をビオチンで、他端をアルカリホスファターゼで標識することができる。２つのプローブを使用する場合、第１プローブすなわち捕捉プローブをビオチンで標識することができ、第２プローブすなわちシグナルプローブをアルカリホスファターゼで標識することができる。３つのプローブを使用する系では、シグナルプローブおよび捕捉プローブを標識することができるが、通常ブリッジプローブは標識しない。アルカリホスファターゼをシグナルプローブの標識として使用する場合、試薬基質を、アダマンチル−１，２−ジオキセタンリン酸、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウム、およびパラニトロフェニルリン酸からなる群から選んでよい。一般に、少なくとも２つの核酸プローブを使用する場合、各プローブの濃度は実質的に同一である。]
[0112] 標的核酸は多数のソースから単離または調製することができる。一実施形態では、細菌またはウイルスのような微生物から核酸を単離することができる。さらに、多細胞生物からの核酸も標的核酸として使用することができる。あるいは、裸の核酸を本発明に使用することもできる。]
[0113] 標的核酸を細胞またはウイルスから単離する必要がある場合、使用可能な核酸単離プロトコルが多数存在する。これらのプロトコルは、溶解／抽出緩衝液を使用した細胞の溶解やウイルスエンベロープおよび外被の破壊を含む場合がある。核酸は、さらにフェノール抽出やエタノール沈澱を含む様々な技術によって精製することができる。これらは核酸単離の簡単な例にすぎず、他のプロトコルも当技術分野でよく知られている。（たとえば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」を参照。）]
[0114] 核酸が単離または他の方法により得られた後、この試料の脱塩が必要となる場合がある。よく知られている方法の１つとして、ＮＡＰカラムの使用が挙げられる。核酸試料を脱塩するには、試料をＮＡＰカラムにアプライし、一連のチューブへ溶出する。試料がカラムを通過したら、エタノール沈澱を使用してさらに精製する。当業者は、核酸試料を脱塩するための他のプロトコルをさらに知っているかもしれない。]
[0115] 凝集物または沈殿が核酸試料に存在する場合、種々のよく知られたプロトコルを使用してこれらを除去することができる。たとえば、核酸試料を、メンブレン濾過、遠心分離等にかけることもできる。当業者は、試料およびそのソースに応じて、微粒子／凝集物を除去する最も効果的な方法を決定することができるだろう。]
[0116] 標的核酸は、ニトロセルロースや、ガラス製またはプラスチック製の顕微鏡用スライド等の表面に固定化することができる。一実施形態において、ＲＮＡが標的であり、かつそのＲＮＡを完全に保つことが適切に考慮されている場合、標的核酸は、ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織もしくは細胞、またはエタノール固定後に透過処理をした細胞等の固定化された細胞内に含まれる。ハイブリダイゼーションは、ヌクレアーゼの存在下においてプローブ−標的二本鎖が形成できる適切な条件下で実施され、検出可能な標識の性質およびその検出に必要とされる条件を考慮に入れた適切な方法によってシグナルが検出される。さらに、プローブ、標的、耐熱性シグナルプローブおよび捕捉プローブ、ならびに耐熱性ヌクレアーゼを混合し、反応混合物中のヌクレオチド配列を変性できる温度に短時間さらしてもよい。次いで、プローブおよび標的ヌクレオチドがハイブリダイズして安定で識別可能な二本鎖を形成することができかつヌクレアーゼが活性を有する温度にまで混合物を冷却することができる。ヌクレアーゼは、高温性または耐熱性であることが好ましく、ヌクレアーゼがＲＮａｓｅＡである場合には、ハイブリダイゼーション温度においてヌクレアーゼがリフォールディングし完全に活性化することができる。標的がＲＮＡである場合、ＲＮＡが広範囲にまたはその最小限が分解するように、高温にさらす時間は５分未満であるべきである。適温は約８５〜９５℃である。]
[0117] 出願人らは、多種類の試料からのＤＮＡおよびＲＮＡを検出するために本発明を広く応用できることを認識しているが、本発明の特徴を最適化するため、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の小サブユニット（ＳＳＵ）を使用して本発明を評価した。具体的には、細菌および真菌からのＳＳＵ ｒＲＮＡを本分析の開発で使用した。]
[0118] 十分な設備を有する分子生物学実験室における経験を積んだスタッフによる実験レベルから、実際の製造条件に分析をスケールアップする際、場合によっては、ＰＣＲ阻害剤、高レベルのヌクレアーゼ、および分析を阻害する可能性のある他のものが著しい障害となりうる。さらに、ｒＲＮＡの二次構造は、その配列相同性によって、種間を適切に識別するプローブの設計が困難となるため、難題となり得る。さらに、リボソームＲＮＡが形成する強固な二次構造・三次構造によって、核酸プローブとのハイブリダイゼーションが困難となり得る。従って、出願人らは、現在の技術と比べて本発明が卓越していることおよび新規であることを実証するためにＳＳＵ ｒＲＮＡを使用した。]
[0119] 必要に応じてジルコニア／シリカビーズを使用して微生物の溶解を行うと、ＲＮＡへの到達が容易になり、ハイブリダイゼーションが起こりやすくなる。溶解は緩衝液系を必要とする場合があり、この緩衝系は、３−（Ｎ−モノホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＳＤＳ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、シリコーンポリマー系消泡剤、および水希釈可能な活性シリコーン（すなわち、水溶液系で発泡を抑制するように設計されたもの）で構成されてもよい。溶解／抽出緩衝液の組成および濃度は最適化することができる。たとえば、溶解／抽出緩衝液は、約１００〜３００ｍＭ ＭＯＰＳ、約１０〜３０ｍＭ ＥＤＴＡ、約１〜３％ＳＤＳ、約５〜１５ｍＭ ＤＴＴ、約０．５〜１．５％シリコーンポリマー系消泡剤、および約０．５〜１．５％ 活性シリコーンを３０％含有する水分散可能なエマルジョン（すなわち、水溶液系で発泡を抑制するように設計されたもの）で構成されてもよい。あるいは、この溶解／抽出緩衝液は、約１５０〜２５０ｍＭ ＭＯＰＳ、約１５〜２５ｍＭ ＥＤＴＡ、約１．５〜２．５％ＳＤＳ、約７．５〜１２．５ｍＭ ＤＴＴ、約０．７５〜１．２５％シリコーンポリマー系消泡剤、および約０．７５〜１．２５％ 活性シリコーンを３０％含有する水希釈可能なエマルジョン（すなわち、水溶液系で発泡を抑制するように設計されたもの）で構成されてもよい。具体的には、この溶解／抽出緩衝液は、約２００ｍＭ ＭＯＰＳ、約２０ｍＭ ＥＤＴＡ、約２％ＳＤＳ、約１０ｍＭ ＤＴＴ、約１％シリコーンポリマー系消泡剤、および約１％ 活性シリコーンを３０％含有する水希釈可能なエマルジョン（すなわち、水溶液系で発泡を抑制するように設計されたもの）で構成されてもよい。溶解後、抽出したＲＮＡから細胞残屑を取り除くために、シリンジフィルタユニットを用いて試料を個々に濾過することができる。試料は、ゲル排除クロマトグラフィー、スピンカラム、および当技術分野で公知の他の方法等の技術を用いて濾過および脱塩することができる。]
[0120] 次いで、抽出したＲＮＡを、ハイブリダイゼーション条件下で核酸プローブとヌクレアーゼとともに同時にインキュベートする。具体的には、本発明は少なくとも１つのプローブを使用する。一実施形態では、本発明は単一プローブを使用し、これはシグナルプローブでもよい。別の実施形態では、本発明は、シグナルプローブおよび捕捉プローブの２つのプローブを使用する。さらなる実施形態では、本発明は、捕捉プローブ、ブリッジプローブおよびシグナルプローブの３つのプローブを使用する。これらのプローブはそれぞれ１６ヌクレオチド以下の標的核酸配列に相補的な配列を持っており、プローブの組み合わせで構成されてもよい。たとえば、１つ以上のシグナルプローブを組み合わせて、すなわちプールして使用してもよい。別の例では、１つ以上の捕捉プローブを組み合わせて、すなわちプールして使用してもよい。このように組み合わせたプローブ、すなわちプローブセットを使用すると、１つ以上の目的配列を検出することができる。]
[0121] 捕捉プローブおよびシグナルプローブの両方が使用され、これらのプローブが、同一のＳＳＵｒＲＮＡ種上のそれぞれの標的とハイブリダイズする場合、一本鎖ＲＮＡ上にあるこれらの標的間に余分な空間が存在することがある。このとき、もしブリッジプローブが適所になければ、ＲＮａｓｅがこの介在配列を切断して、捕捉プローブとシグナルプローブとが別個のＲＮＡ−プローブ複合体に分かれてしまい、検知ステップにおいて検出ができなくなることが予測される。しかしながら、驚くべきことに、ブリッジプローブを使用しない例であっても、このような、検出ができなくなる状況は発生しない。本発明では、予測に反し、ＲＮＡの２つのセグメント間がＲＮａｓｅの作用によって切断されることはない。したがって、これらのＲＮＡセグメントは互いから分割されず、捕捉プローブおよびシグナルプローブが縦に並んだ外観が保たれる。]
[0122] ＲＮａｓｅは、少なくとも１つの核酸プローブとともに、抽出したＲＮＡのインキュベーション中に加えられる。これによって、ＲＮＡは破壊されるが、ハイブリダイズが可能な程度でとどまる。加えるＲＮａｓｅが多すぎれば、ＲＮＡは完全に分解される。インキュベーション中に加えてもよいＲＮａｓｅの量は、約１０〜４０ｎｇ、あるいは約１５〜２５ｎｇである。反応混合物に加えるＲＮａｓｅの量は、約２５ｎｇであってもよい。]
[0123] ハイブリダイゼーション分析で使用されるヌクレアーゼの有用濃度は、約１．０−１２〜２．０ユニット、または約０．００２〜０．１６ユニットであり得る。たとえば、ハイブリダイゼーション反応量１５０μｌに対して、ＲＮａｓｅＡの濃度または量は、約０．０１〜１μｇ、好ましくは約１〜８０ｎｇ、特に約４〜４０ｎｇの範囲である。品質の高いすなわちより純粋なＲＮａｓｅ Ａは、この酵素活性の典型的な分析に基づくと、純粋な酵素１マイクログラム当たり２ユニットの範囲において特異的な活性を持っている。当業者は、ヌクレアーゼのこのような濃度が、分析に使用されるヌクレアーゼまたはヌクレアーゼの組み合わせだけでなく、反応量、標的およびプローブヌクレオチド濃度、分析時間、および温度に依存することを認識するだろう。]
[0124] 単一塩基のみが異なるような非常に相同性の高い標的配列同士を識別する場合、実質的により高い濃度の１つのヌクレアーゼまたは複数のヌクレアーゼが必要とされる。このような単一塩基を識別可能なヌクレアーゼの濃度範囲は、通常上記の濃度範囲よりも２〜１０００倍高い。しかしながら、ほとんどの場合、非常に相同性の高い標的を識別するために必要な濃度は２〜１００倍である。また、本発明の分析で使用される核酸プローブによって、標的配列とそれと相同な非標的配列とを単一塩基の差で識別するためには、鎖切断モチーフに対してより広い特異性を持つ複数のヌクレアーゼが必要とされることもある。たとえば、アルカリホスファターゼで標識されたシグナルプローブとビオチン化された捕捉プローブとを使用する場合、反応温度約２０〜５０℃におけるＲＮａｓｅＡの最適な濃度として、約１〜１２０ｎｇが挙げられる。当業者は、異なる反応量およびプローブ濃度等により条件の最適化が必要となること、および本明細書の開示によりそのような条件は容易に決定できることを認識するだろう。]
[0125] ＲＮａｓｅとして、ウシの膵臓由来のＲＮａｓｅ Ａ、またはそれと同等の、一本鎖ＲＮＡには作用するが二本鎖ＲＮＡやＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドには作用しない、その他のＲＮａｓｅが好適である。ＲＮａｓｅ Ａは、一本鎖ＲＮＡのピリミジン残基の３’リン酸結合を特異的に切断し、ピリミジン３’リン酸、および末端ピリミジン３’リン酸を持つオリゴヌクレオチドを生じる。この酵素は、活性化に補因子および二価陽イオンを必要としない。一般に、ＲＮａｓｅ Ａを、
ａ）ＲＮＡまたはＤＮＡマッピングにおける、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドからのハイブリダイズされていないＲＮＡ領域の切断、
ｂ）ＤＮＡミニプレップに混入したＲＮＡの除去、
ｃ）組み換えタンパク質の調製、
ｄ）リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、
ｅ）プラスミドおよびゲノムＤＮＡ単離、および
ｆ）ＤＮＡまたはＲＮＡ中の単一塩基変異のマッピング
等のアプリケーションに使用してもよい。]
[0126] 別のヌクレアーゼとして、ＲＮａｓｅＴ１が好ましい。ＲＮａｓｅ Ｔ１は、たとえば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）から単離することができ、一本鎖ＲＮＡのＧ残基を特異的に分解するエンドリボヌクレアーゼである。ＲＮａｓｅ Ｔ１は、３’−グアニン残基と、隣接するヌクレオチドの５’−ＯＨ残基との間のリン酸ジエステル結合を切断し、これらに対応する中間体である２’，３’−環状リン酸を形成する。この反応による産物は、３’−ＧＭＰおよび末端３’−ＧＭＰを持つオリゴヌクレオチドである。ＲＮａｓｅ Ｔ１は、活性化に金属イオンを必要としない。]
[0127] ＲＮａｓｅＴ１も種々のアプリケーションに使用してよい。ＲＮａｓｅ Ｔ１を、
ａ）ＤＮＡ調製物からのＲＮＡの除去、およびＲＮＡの塩基配列決定、
ｂ）リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、
ｃ）ＲＮａｓｅ Ａとの併用、
ｄ）組み換えタンパク質調製物からのＲＮＡの除去、および
ｅ）「Ｇ−ｌｅｓｓ ｃａｓｓｅｔｔｅ」を含むＤＮＡテンプレートからインビトロで合成されたＲＮＡ転写レベルの測定
に使用してもよい。
ＲＮａｓｅ Ｔ１の阻害剤として、金属イオンとモノヌクレオチドが挙げられる。ＲＮａｓｅ Ｔ１の特異的阻害剤として、グアニリル−２’，５’−グアノシンが挙げられる。]
[0128] 本発明で使用してもよい第３のＲＮａｓｅとして、ＲＮａｓｅ Ｉが挙げられる。ＲＮａｓｅ Ｉは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から単離してもよい。シトシンとウリジンの後ろだけを切断するＲＮａｓｅ Ａとは異なり、ＲＮａｓｅ Ｉは、あらゆるジヌクレオチド間を切断することによって、２’，３’−環状モノリン酸中間体を経由させて、一本鎖ＲＮＡをヌクレオシド３’−モノリン酸に分解する。さらに、この酵素は、７０℃で１５分間加熱することにより完全に不活性化されるため、後に続く多数の処理を行う前にこの酵素を除去する必要はない。]
[0129] ＲＮａｓｅＩを
ａ）ＤＮＡ調製物からのＲＮＡ除去、および、
ｂ）ＲＮＡ：ＲＮＡおよびＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド内に存在する単一塩基対のミスマッチを検出するための、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ
等のアプリケーションに使用してもよい。]
[0130] さらに、当業者は、分析で使用するＲＮａｓｅの量を様々な基準に応じて最適化してもよいことを理解するだろう。たとえば、当業者は、分析で使用するＲＮａｓｅの最適な量を決定し、分析量、存在する標的物質の量、分析反応時間、および分析反応温度等の特定の変量を考慮して、この量を修正することができるだろう。]
[0131] 本発明中で使用してもよい別の酵素として、Ｓ１ヌクレアーゼが挙げられる。具体的には、Ｓ１ヌクレアーゼは、一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡをエンドヌクレアーゼ的に分解し、５’位をホスホリル基で終端された産物を生成する。二本鎖の核酸（ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡ）は、この酵素の濃度が非常に高い場合を除き、この酵素による分解に対して耐性を示す。Ｓ１ヌクレアーゼを、二本鎖ＤＮＡからの一本鎖末端の除去、一本鎖ＤＮＡの選択的開裂、およびＲＮＡの転写マッピングに使用してもよい。]
[0132] ヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ＮＰＡ）は、細胞から抽出されたヘテロＲＮＡ試料中に存在する個々のＲＮＡ分子を同定するための、生化学および遺伝学で使用される検査手技である。この技術によれば、総濃度が低くても、配列が既知である１つ以上のＲＮＡ分子を同定することができる。ＮＰＡでは最初に、抽出したＲＮＡを、その配列すなわち目的配列に相補的なアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡプローブと混合し、これらの相補鎖をハイブリダイズさせ、二本鎖のＲＮＡ（またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド）を形成させる。次いで、二本鎖のＲＮＡに対し活性を示さず一本鎖ＲＮＡのみを特異的に切断するリボヌクレアーゼを混合物に作用させる。反応が終わりに近づくと、感受性のＲＮＡ領域が、非常に短いオリゴマーまたは個々のヌクレオチドに分解される。残存したＲＮＡ断片は、添加したアンチセンス鎖に相補的なものであり、したがって目的配列を含む。プローブがＤＮＡ分子である場合はＳ１ヌクレアーゼを使用し、プローブがＲＮＡである場合は一本鎖に特異的なリボヌクレアーゼのいずれを使用してもよい。残存したプローブ−ＲＮＡ相補体が検出される。ヌクレアーゼプロテクションアッセイは、イントロンならびに転写遺伝子領域の５’末端および３’末端をマッピングするために使用される。もとの細胞抽出物に存在する標的ＲＮＡの量についての定量的結果を得ることができ、標的がメッセンジャーＲＮＡである場合、この定量的結果は細胞の遺伝子の転写レベルを表す。]
[0133] 本発明で使用されるヌクレアーゼは、試料中の目的ヌクレオチド配列を分解できる。しかしながら、目的ヌクレオチド配列が反応中に形成される複合体に結び付けられていない、すなわち、その複合体中に含まれていない場合、ヌクレアーゼによりこの目的ヌクレオチド配列が分解される可能性がある。目的ヌクレオチド配列および核酸プローブを含む複合体が形成されると、ヌクレアーゼが目的配列やプローブを分解する可能性は低い。]
[0134] ハイブリダイゼーション条件として、液相ハイブリダイゼーションまたは固相支持体を用いたハイブリダイゼーションで使用される条件を使用することができる。あるいは、ハイブリダイゼーション条件として、液相ハイブリダイゼーションで使用する成分および固相支持体を用いたハイブリダイゼーションで使用する成分の両方を使用することもできる。]
[0135] ハイブリダイゼーション反応では、緩衝液（ＭＯＰＳ、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、ツウィーン（登録商標）２０、アジ化ナトリウム、およびカルボン酸リチウムを含む陰イオンフッ素界面活性剤）、プローブ１（配列番号：１、表２参照）および、プローブ２（配列番号：２、表２参照）を使用することができる。プローブの使用量は、１プローブ当たり、約１〜１００ｐｍｏｌ、約２〜５０ｐｍｏｌ、または５ｐｍｏｌであってよい。プローブ成分の量は、分析終了時の全体量に依存する。通常、分析の対象となる標的核酸に対し実質的に過剰量のプローブを使用する。これらのプローブは、通常、互いに等モル量で使用される。場合によっては、これらのプローブが互いに異なるモル比であると有利なこともある。たとえば、２つのプローブを用いたハイブリダイゼーションにおいて、捕捉プローブがシグナルプローブよりも高い濃度であると有利な場合がある一方、他の状況においては、この逆の割合でプローブを使用すると好ましい場合もある。]
[0136] ハイブリダイゼーション緩衝液、プローブおよびＲＮａｓｅＡを混合してからインキュベートする。ハイブリダイゼーション反応および分析全体は環境温度または高温のいずれで行ってもよい。ハイブリダイゼーションは約２０〜５５℃の温度範囲で行うことができる。ハイブリダイゼーション反応を約３１℃または約４２℃で行ってもよい。]
[0137] ハイブリダイゼーション緩衝液を、特定の濃度の様々な成分で構成してもよい。たとえば、ハイブリダイゼーション緩衝液を、約１００〜３００ｍＭ ＭＯＰＳ、約１〜３Ｍ塩化ナトリウム、約０．０１〜０．１％（ｖ／ｖ）ツウィーン２０、約０．００５〜０．０１５％アジ化ナトリウム、および約０．１〜０．３％（ｖ／ｖ）ゾニールＦＳＡ（カルボン酸リチウムを含む陰イオンフッ素界面活性剤）で構成してもよい。ハイブリダイゼーション緩衝液のｐＨは、約６〜８、約６．５〜約７．５、または約６．９であってもよい。上記ハイブリダイゼーション緩衝液を、約１５０〜２５０ｍＭ ＭＯＰＳ、約１．５〜３．５Ｍ塩化ナトリウム、約０．０２〜０．０７％（ｖ／ｖ）ツウィーン２０、約０．００７〜０．０１２％アジ化ナトリウム、および約０．１５〜０．２５％（ｖ／ｖ）ゾニールＦＳＡ（カルボン酸リチウムを含む陰イオンフッ素界面活性剤）で構成してもよい。上記ハイブリダイゼーション緩衝液を、約２００ｍＭ ＭＯＰＳ、３Ｍ塩化ナトリウム、約０．０５％（ｖ／ｖ）ツィーン２０、約０．０１％アジ化ナトリウム、約０．２％（ｖ／ｖ）ゾニールＦＳＡ（カルボン酸リチウムを含む陰イオンフッ素界面活性剤）で構成し、約ｐＨ６．９としてもよい。上記の補助成分を含む、トリス緩衝食塩水等の他の緩衝液も、同様の効果を伴って使用することができ、このような緩衝液は当技術分野においてよく知られている。緩衝液は、検出を妨げたり他の分析成分を不活性化する成分を含んではならない。たとえば、ＳＤＳはアルカリホスファターゼを不活性化するため、アルカリホスファターゼで標識したプローブを使用するハイブリダイゼーションでは使用してはならない。]
[0138] 本発明で使用するために評価された好適なハイブリダイゼーション緩衝液として、以下のものが挙げられる。]
[0139] ＴＭＡＣ［３Ｍ ＴＭＡＣ、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、０．１％ツウィーン２０、０．００６７％アジ化Ｎａ］；]
[0140] ＴＢＳ［０．１Ｍトリス、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ツウィーン２０、０．０１％アジ化Ｎａ］；]
[0141] ＭＯＰＳ／マンノース［５０ｍＭ ＭＯＰＳ、２００ｍＭマンノース、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ツウィーン２０］；]
[0142] ３Ｍ ＴＭＡＣ、ＴＥ（３．３ｍＭトリス、０．３３ｍＭＥＤＴＡ）、０．１％ＳＤＳ；]
[0143] ０．２Ｍ ＴＥＡＣ、ＴＥ（３．３ｍＭトリス、０．３３ｍＭＥＤＴＡ）、０．１％ＳＤＳ；]
[0144] ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ）、０．０５％ツウィーン２０；]
[0145] ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ）、０．０５％ツウィーン２０、１％高分子量ＰＥＧ；]
[0146] ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ）、０．０５％ツウィーン２０、１％低分子量ＰＥＧ；]
[0147] ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ）、０．０５％ツウィーン２０、１０ｍＭ Ｄ−マンノース；]
[0148] ０．２Ｍ ＴＥＡＣ；]
[0149] １Ｍ ＴＥＡＣ；]
[0150] ３Ｍ ＴＭＡＣ；]
[0151] ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０９Ｍクエン酸Ｎａ）、０．１％ＳＤＳ；および]
[0152] １×ＰＣＲ緩衝液（プロメガ社製、ｃａｔ＃Ｍ８９０１）、５ｍＭ塩化マグネシウム。]
[0153] 上記の緩衝液のいずれを使用しても、それぞれのＳＳＵｒＲＮＡを識別するように設計されたプローブを用いて、異なる標的生物を適切に検出かつ識別することができた。一実施形態として、実施例１で使用されるハイブリダイゼーション緩衝液が好ましい。ハイブリダイゼーション緩衝液は、２×濃縮で調製しておき、その後、実施例９で使用されているような、ハイブリダイゼーション緩衝液の１×作業濃度に希釈することができる。]
[0154] ヌクレアーゼとハイブリダイゼーション成分とを組み合わせる別の実施形態は、試料中に標的ヌクレオチド酸配列が存在する場合に、その配列と少なくとも１つの標識された核酸プローブとがどのぐらいハイブリダイズしたかという程度に関するものである。たとえば、ヌクレアーゼは、プローブ：標的ハイブリダイゼーション複合体またはハイブリダイゼーションのパーセンテージが、約０〜９５％、約５〜９５％、約５％〜７５％、約１５〜６５％、または約１５〜５０％進んだ後に加えられる。あるいは、このハイブリダイゼーションのパーセンテージは約４０〜９５％である。当業者は、このハイブリダイゼーションの程度を利用して、ヌクレアーゼとハイブリダイゼーション反応の他の成分とを組み合わせる適切な時点を決定できることを認識するだろう。]
[0155] フッ素界面活性剤はゾニールＦＳＡでもよく、これを使用することによってハイブリダイゼーションにおける非特異結合と試料の発泡との両方を低減できる。核酸プローブはハイブリダイゼーション前に希釈緩衝液で希釈するが、この希釈緩衝液はトリス、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよびアジ化ナトリウムで構成されてもよい。]
[0156] ハイブリダイゼーションは液相で行うことができる。しかしながら、捕捉プローブを捕捉するのではなく、固相に固定化してもよい。プローブを固定化する方法は当技術分野でよく知られている。好適な固相：捕捉プローブの実施形態として、１０ナノメートル〜１ミクロンのナノ粒子が挙げられ、このサイズの粒子を用いることによって、液相で行った場合と非常によく似た反応およびハイブリダイゼーション動態を得ることができる。捕捉プローブを結合するのに適した粒子は、量子ドット、常磁性粒子、蛍光として検出できるビーズ、または金が挙げられる。一実施形態では、マイクロタイタープレート、個々のチューブ、またはチューブストリップの壁もしくはウェルに捕捉プローブを付着させる。別の実施形態では、固相はニトロセルロース等のメンブレンである。別の実施形態では、捕捉プローブはフローストリップ等に固定化される。]
[0157] 特に、２つまたは３つのプローブを用いた実施形態では、固定化された捕捉プローブを用いて単一のチューブ内でハイブリダイゼーションを行うことができる。単一のチューブ内においてハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼによる分解を行い、次いで非結合種を除去するために洗浄し、さらに標的プローブセット複合体中のシグナルプローブを検出する。実施例において説明されるように、ハイブリダイゼーションを１本のチューブ内で行い、さらに捕捉および検出を行うため別個のチューブに移してもよい。さらに、単一のプローブを使用した別の実施形態では、標識された単一の蛍光プローブと、プローブの標的核酸を含むまたは含む可能性のある試料と、ヌクレアーゼとを合わせ、次いで変性を起こし、ハイブリダイズされたプローブ：標的二本鎖を蛍光偏光法によって検出する。]
[0158] 本分析で使用されるシグナルプローブ、捕捉プローブおよびブリッジプローブを、約０．７５〜１．７５ｐｍｏｌ／μｌ、または約１〜１．５ｐｍｏｌ／μｌに希釈してもよい。これらのプローブを、ＡＰ（アルカリホスファターゼ）希釈緩衝液で約１．２５ｐｍｏｌ／μｌに希釈することもできる。ＡＰ希釈緩衝液を、約５０〜１５０ｍＭトリス、約５０〜１５０ｍＭ塩化ナトリウム、約１〜１０ｍＭ塩化マグネシウム、および約０．００１〜０．０２％アジ化ナトリウムで構成してもよい。ＡＰ希釈緩衝液のｐＨは、約８〜１０、約８．５〜９．５、または約９．０であってよい。ＡＰ希釈緩衝液を、約７５〜１２５ｍＭトリス、約７５〜１２５ｍＭ塩化ナトリウム、約２．５〜７．５ｍＭ塩化マグネシウム、および約０．００７５〜０．０１５％のアジ化ナトリウムで構成してもよい。さらに、ＡＰ希釈緩衝液を、約１００ｍＭトリス、約１００ｍＭ塩化ナトリウム、約５ｍＭ塩化マグネシウム、および約０．０１％アジ化ナトリウムで構成し、ｐＨ約９．０としてもよい。]
[0159] 本発明の分析で使用されるプローブは、本分析で使用されるヌクレアーゼまたはヌクレアーゼの組み合わせに対して耐性または不活性であるべきである。本分析においてＲＮａｓｅを使用する場合、プローブはＤＮＡ組成物であってもよく、本分析においてＳ１ヌクレアーゼを使用する場合、プローブはＲＮＡであってもよい。当業者は、本分析でＲＮａｓｅが使用されているにもかかわらずプローブがＲＮＡで構成されている場合、プローブが２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド等の修飾ヌクレオチドで構成されるようにするなど、ヌクレオチド配列プローブの主鎖に修飾を加えて、ヌクレアーゼに対する耐性を持たせることができることを熟知しているだろう。同様に、ＤＮＡ標的またはＲＮＡ標的を対象とするプローブの主鎖のヌクレオチド結合は、ホスホチオエート、ペプチド結合（たとえば、ＰＮＡ）、またはモノホリノ基で構成することができる。このヌクレオチド配列の長さは、１０〜１００ヌクレオチド、１２〜３０ヌクレオチド、または１２〜２５ヌクレオチドであり得る。]
[0160] 当業者は、プローブの長さおよびヌクレオチド組成がハイブリダイゼーション温度に影響を及ぼすことを認識かつ理解することができる。さらに、この組成と長さは、選択された標的ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションの特異性、および非標的ヌクレオチド配列との交差反応の可能性に影響を及ぼす。このことは、標的が類似した生物や相同な遺伝子からの相同配列であり、微細なセグメントの変化（たとえば、がんのｐ５３遺伝子のＳＮＰ）を検出するように、あるいは異なる生物のリボソームＲＮＡの小／大ユニットを識別するように本分析を設計する場合に特に当てはまる。このような場合、標的配列とプローブとのハイブリダイゼーションを最大限にし、かつ非標的配列とのあらゆる交差反応を最小限にするため、プローブを短くすべきであり、その長さは通常１２〜１８ヌクレオチド長である。]
[0161] 別の実施形態では、標的配列とハイブリダイズすることができる単一プローブを、放射性物質である３２Ｐおよび３３Ｐ、ならびにテトラメチルローダミンおよびＣｙ３等の蛍光標識等の検出可能な標識で標識する。一実施形態では、プローブは検出可能な標識を有する単一プローブである。別の実施形態中では、試料中に存在する可能性のある複数の標的配列を検出できるように、別々に検出できかつ別々に識別可能な標識が付着したプローブを複数使用する。たとえば、遺伝子内のＳＮＰの存在を検出するために、一方のプローブが標的遺伝子の野生型対立遺伝子を検出するためにＣｙ３で標識され、他方のプローブが変異型対立遺伝子を標的とする、２つのプローブを使用してもよい。さらに、別々に検出可能かつ識別可能な標識を有する多数のプローブを調製することができ、この場合は、このようなプローブを用いたマルチプレックスアッセイで使用される標識を識別する方法の性能によってのみ制限される。重要なことには、断片解析法によって複数のプローブとそれぞれの標的とのハイブリダイゼーションを検出する場合、複数のプローブ：標的二本鎖を識別するための追加手段として、形成された二本鎖のサイズを利用することができる。]
[0162] 既に述べたように、標的核酸を検出するために使用されるプローブは、捕捉プローブおよびそれと組となるシグナルプローブのセットで構成することができる。一実施形態では、捕捉プローブとシグナルプローブとの１ペアを、試料中に存在する他のヌクレオチド配列から標的ヌクレオチド配列を検出するために調製する。別の実施形態では、単一のシグナルプローブについて上述したことを考慮に入れると、試料中に存在する複数の標的ヌクレオチド配列を検出するために、別々に検出可能かつ識別可能な複数のシグナルプローブを有する、捕捉プローブおよびシグナルプローブのペアを複数組使用することができる。]
[0163] 同様に、プローブセットの一実施形態では、試料中に存在する標的ヌクレオチド配列を検出するように設計したプローブセットは、捕捉プローブ、ブリッジプローブ、およびシグナルプローブのセットで構成することができる。デュアルプローブについて上述したように、単一のシグナルプローブついて上述したことを考慮に入れると、トリプルプローブを使用する別の実施形態では、試料中に存在する複数の標的ヌクレオチド配列を検出するために、それぞれが別々に検出可能かつ識別可能なシグナルプローブを有する、試料中の複数の標的ヌクレオチド配列を検出するように設計されたトリプルプローブセットを複数組使用する。]
[0164] 分析の対象となる試料中の標的ヌクレオチド配列の予測される濃度に対し、実質的に過剰量のプローブを使用することが好ましく、プローブと標的の比率は、通常１０：１〜１０００：１である。当業者によって理解されるように、バックグラウンドまたは非特異結合に起因すると考えられるシグナルを最小限にすることができる場合、標的に対するプローブの比率をより高くすることができる。さらに、標的に対するプローブの比率をより低くすることもできる。しかしながら、この場合、ハイブリダイズするのに必要な時間は実質的に増加する。]
[0165] 本分析で複数のプローブを使用する場合、これらのプローブの濃度が同様、またはほぼ同一、すなわち１：１であることが好ましい。別の実施形態では、複数の上記デュアルプローブセットまたはトリプルプローブセットが本分析に使用され、それぞれのシグナルプローブは共通の捕捉プローブを持つが、これらのシグナルプローブが別々に検出可能かつ識別可能であることによって、試料中の異なる標的ヌクレオチド配列の識別が可能となる。さらに別の実施形態では、それぞれのシグナルプローブが試料中に存在する異なる標的ヌクレオチド配列を識別することができ、これらと組をなす、捕捉プローブとブリッジプローブとが同一の配列を有してもよい。]
[0166] プローブは、液相または凍結乾燥状態で提供されてもよい。さらに、プローブを凍結乾燥する場合、再形成した際にヌクレアーゼおよびプローブが本分析に適切な濃度となるよう、ヌクレアーゼをプローブとともに凍結乾燥してもよい。]
[0167] プローブ末端、すなわちスペーサーは、当技術分野で公知であり、上述されている。別の実施形態では、プローブ末端すなわちスペーサーは、ジップコード（ｚｉｐ ｃｏｄｅ）またはバーコード配列で構成されている。表面（たとえば、アレイ）、または蛍光として検出できるビーズ（たとえば、ルミネックス社（テキサス州オースティン）やＰｏｌｙＡｎ Ｇｍｂｈ（ドイツ、ベルリン）から入手可能なビーズ）に固定化されたジップコードまたはバーコードの相補的配列と、プローブ：標的複合体が有するジップコード末端またはバーコード末端とが対応することによって、プローブ：標的複合体を捕捉することができる。]
[0168] 進歩的な本分析で使用してもよい核酸プローブには種々のものがある。これらのプローブは、プローブの５’または３’末端のどちらかに付加されたスペーサーを有してもよく、ハイブリダイゼーション中のステアリン酸による阻害を低減するために、これらのスペーサーを使用してもよい。このようなスペーサーは、ポリエチレングリコールスペーサー、アルキル鎖、または同種のヌクレオチドが７〜１０個連なったポリＴ鎖等であってよい。ポリエチレングリコールスペーサーおよびアルキル鎖スペーサーを、ビオチンとともに使用してよい。これらのプローブは、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、蛍光標識、酵素標識および色素体標識からなる群から選ばれる検出可能な部分で標識される。これらのプローブは、配列番号：１〜４を含む特定のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。]
[0169] 化学発光標識は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）、ルミノールおよびルシフェラーゼ／ルシフェリンの組み合わせからなる群から選ばれてもよい。化学発光標識および生物発光標識は、化学発光反応および生物発光反応によって最終的に検出される前駆体でもよい。試薬基質の添加に際して、これらの検出可能な標識は特徴的な挙動を示し、特定の微生物の検出を可能にする。Ｃｅｌｓｉｓ Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ等のルミノメーターを使用して、これらの特徴的な挙動を検出してもよい。]
[0170] 化学発光標識または生物発光標識で標識したプローブを使用する場合、試薬基質は、ルシフェラーゼ／ルシフェリン／アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）の組み合わせ、ルシフェラーゼ／ルシフェリンの組み合わせ、およびＡＴＰからなる群から選ばれる。さらに、アルカリホスファターゼとＬｕｍｉｇｅｎ社によって提供されているＬｕｍｉ−Ｐｈｏｓ５３０、Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ４８０、Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ Ｐｌｕｓ等の１,２−ジオキセタン化合物やロシュ社（インディアナ州インディアナポリス）によって提供されている類似の基質を含むリン酸化された潜在化学発光基質との組み合わせ、および西洋ワサビペルオキシダーゼやルミノールを使用することができる。アダマンチル−１，２−ジオキセタンリン酸やその同等物は、アルカリホスファターゼの直接基質であり、Ａｔｔｏｇｌｏｗ（登録商標）ＡＰＳｕｂｓｔｒａｔｅ ４５０ＬＢ（Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、アメリカ、ミシガン州ロイヤルオーク）等の商品名で販売されている。シグナルを生成する酵素としてアルカリホスファターゼを使用する利点として、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウム）等の肉眼で見えるものや、パラニトロフェニルリン酸等の化学発光の基質としては適度の感度を有するものに基質を変更することによって、広範囲な望ましい分析感度を選択することができることが挙げられる。]
[0171] 別の実施形態では、本分析の緩衝液および個々の成分は、試薬を添加および組み合わせる際の視覚的な指標として使うことができる色素または他の着色剤を含んでもよく、これによって確実かつ適切に試薬を構築し、混合し、これらのｐＨの調整をすることができる。好適な着色剤として、米国食品医薬品局が承認した７種のＦＤ＆Ｃ着色剤が挙げられる。
（ＦＤ＆Ｃ青色１号−ブリリアントブルーＦＣＦ、Ｅ１３３（青色系）、
ＦＤ＆Ｃ青色２号−インジゴチン、Ｅ１３２（紺青色系）、
ＦＤ＆Ｃ緑色３号−ファストグリーンＦＣＦ、Ｅ１４３（青みがかった緑色系）、
ＦＤ＆Ｃ赤色４０号−アルラレッドＡＣ、Ｅ１２９（赤色系）、
ＦＤ＆Ｃ赤色３号−エリスロシン、Ｅ１２７（桃色系）、
ＦＤ＆Ｃ黄色５号−タートラジン、Ｅ１０２（黄色系）、および
ＦＤ＆Ｃ黄色６号−サンセットイエローＦＣＦ、Ｅ１１０（橙色系）。）
視覚的指標として使用するのに適切な濃度は、所望の着色度および視覚化に対する適合性に依存することが多く、通常、色素の濃度は０．００１〜０．１重量％である。色素を様々に組み合わせることによって、可視スペクトルの大部分に及ぶ多様な色が得られ、それらは個々の試薬に加えたときに他と難なく識別することができる色となる。さらに、試薬を混合することによって色素も混合され、識別可能な異なる色となる。このような色の変化は、成分の添加が正しく行われていること、また数種類の試薬の混合が行われる場合にはその順序が適切であることを示す視覚的な指標となる。]
[0172] 目的とする核酸配列および／または微生物を検出および同定するキットを調製してもよく、このキットは、検出可能な標識で標識された少なくとも１つのヌクレオチドプローブ、フッ素界面活性剤、および目的配列を分解できるヌクレアーゼを含んでもよい。別の実施例では、試薬基質、溶解／抽出緩衝液、ハイブリダイゼーション緩衝液、および／または洗浄緩衝液を含んでもよい。さらに、微生物を溶解するのに有用なジルコニア／シリカビーズをキットに含んでもよい。上述したような分析に常磁性ビーズを使用する場合、このようなビーズをキットに含んでもよい。このような常磁性ビーズは、ＲＮＡに結合するプローブで標識されてもよく、ＲＮＡと結合する追加の１つまたは複数のプローブを使用して検出を行う。リポソームで被包された発光試薬を使用してもよく、検出可能なシグナルをさらに大きく増幅することができる。]
[0173] キットは、抽出された目的ヌクレオチド配列のクリーンアップ用カラムおよび分析チューブをさらに含んでもよい。分析チューブを、検出分析に有用な化合物（たとえば、ストレプトアビジン）でコーティングしてもよい。]
[0174] 本発明の検出分析は、様々な試料中に存在する、細菌、真菌または他の微生物等の微生物を検出するために使用してもよい。さらに、本発明の検出分析は、試料中に存在する目的核酸配列を検出するために使用してもよい。このような試料として、食品、環境試料、臨床試料、水、飲料、液体ソープ、日焼け止め、化粧品、練り歯磨き、柔軟仕上げ剤、洗浄剤、化粧水、およびパーソナルケア製品（ＰＣＰ）が挙げられる。さらに、本分析によって、グラム陰性菌とグラム陽性菌とを識別することができる。グラム陰性菌に特異的なプローブを使用した場合、この種の細菌のみが陽性を示すため、大多数のグラム陽性菌は検出されない。]
[0175] さらに、本検出分析の産物をＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ等の追加分析で使用してもよい。これらの分析は、核酸配列を増幅するために使用できる。増幅することにより、検出は簡便かつ再現性の高いものとなる。ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲを用いることにより、分析の感度を増加させるだけでなく、産物を定量することが可能となる。]
[0176] 本発明は、さらに、タンパク質、ペプチド、小型化学分子（ｓｍａｌｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、炭水化物、リポ多糖、多糖、脂質等の、目的とする標的の検出分析に関する。これらに適切なプローブは、検出可能な標識で標識することができる。たとえば、抗原を、放射性標識、化学発光標識、生物発光標識、蛍光標識または電気化学標識で標識することができ、それによって対応する抗体による検出が可能となる。]
[0177] さらに、多くのアプリケーションにおいて、非特異結合や不要な結合を低減するために、フッ素界面活性剤を使用することができる。上述したように、少なくとも１つのフッ素界面活性剤を、緩衝液または他の液体に加えてアプリケーションを実施すれば、非特異結合は低減する。さらに、フッ素界面活性剤は、多くの材料の表面へのまたは相互間の接着または結合を防ぐ。たとえば、本発明は、細胞、細胞内小器官、生体分子または化学分子の非特異結合を低減させる方法であって、少なくとも１つのフッ素界面活性剤を緩衝液に加えること、および該細胞、細胞内小器官、生体分子または化学分子を該緩衝液と接触させることを含み、該少なくとも１つのフッ素界面活性剤の存在によって、該細胞、細胞内小器官、生体分子または化学分子の、表面へのまたは相互間の非特異結合が低減することを特徴とする方法に関する場合もある。この方法は、細胞、タンパク質、ペプチド、核酸、小型化学分子（ｓｍａｌｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、炭水化物、リポ多糖類、多糖、および脂質に使用されるが、これらに限定されない。この方法は、非常に有益な効果を示し、より簡便であり、より再現性のよい結果をもたらす。]
[0178] どの薬剤または物質が、非特異結合を低減または実質的に低減することができるのかを判断する場合、特定の所望の性質として以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
・非特異性の疎水性結合、イオン結合、および共有結合を含む、表面への分析成分の非特異結合（ＮＳＢ）の抑制
・反応ベッセルや反応容器の表面、またはメンブレン等の他の表面と分析成分または試料成分との間の非特異性相互作用の抑制
・特に、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ストレプトアビジン、核酸、グリコシル基、脂肪酸、脂質、炭水化物等の分析成分と、抗体との間で交差反応性がないこと
・固定化および／または乾燥に付随して相転移とともに起こりうるタンパク質変性による影響の最小化
・一般に冷蔵保存または凍結保存される希釈用試薬に使用するタンパク質または他の分子の安定化
・（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼの）夾雑酵素活性がまったくないか、またはほとんどないこと
・分析中に酵素活性が存在する場合、その抑制
・固定化された分析成分が破壊されていないこと、または目的の生体分子または特定のタンパク質の検出が阻害されていないこと
・感染性因子を含まないこと
・再現性のあるパフォーマンス]
[0179] 本明細書に記載のフッ素界面活性剤は、本明細書の記載により例証されるような特性を有し、本開示の実施形態および実施例で説明されるような形態で使用される。]
[0180] 本発明を、以下の実施例でさらに詳細に説明するが、これらに限定されない。通常の方法および上述されかつ以下で例証されるキットを考慮に入れたうえで、当業者は、本発明の範囲内である様々な選択肢を容易に決定することができるだろう。]
[0181] 実施例１
微生物保存培養株の増殖および調製
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標）、アメリカ、バージニア州マナッサス）から入手した既知の微生物を使用して、下流分析に適した核酸を得るために使用される溶解プロトコルを試験した。]
[0182] ]

权利要求:

請求項1
試料中に存在する少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を検出する方法であって、ａ）少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を含む可能性のある試料を提供すること、ｂ）ｉ）該試料と、ｉｉ）検出可能な標識で標識した少なくとも１つの核酸プローブと、ｉｉｉ）目的配列を分解することができるヌクレアーゼとを、ヌクレアーゼをプローブよりも前またはプローブと同時に試料に加えて混合することにより混合物を作製し、これによって目的配列とプローブとの複合体を形成させること、およびｃ）その存在が目的配列の存在を意味する、複合体中の該検出可能な標識のレベルを測定することを含む方法。
請求項2
試料中に存在する少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を検出する方法であって、ａ）少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を含む可能性のある試料を提供すること、ｂ）ｉ）該試料と、ｉｉ）検出可能な標識で標識した少なくとも１つの核酸プローブと目的配列を分解することができるヌクレアーゼとの混合物とを混合して混合物を作製し、これによって目的配列とプローブとの複合体を形成させること、およびｃ）その存在が目的配列の存在を意味する、複合体中の該検出可能な標識のレベルを測定することを含む方法。
請求項3
試料中に存在する少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を検出する方法であって、ａ）少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を含む可能性のある試料を提供すること、ｂ）ｉ）該試料と、ｉｉ）検出可能な標識で標識した少なくとも１つの核酸プローブと、ｉｉｉ）目的配列を分解することができるヌクレアーゼとを、プローブを選択した時間内に試料に加えて混合することにより混合物を作製し、これによって目的配列とプローブとの複合体を形成させること、およびｃ）その存在が目的配列の存在を意味する、複合体中の該検出可能な標識のレベルを測定することを含む方法。
請求項4
前記選択した時間が、ヌクレアーゼを加えた後約０〜１５分間であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
請求項5
試料中に存在する少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を検出する方法であって、ａ）少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を含む可能性のある試料を提供すること、ｂ）ｉ）該試料と、ｉｉ）検出可能な標識で標識した少なくとも１つの核酸プローブと、ｉｉｉ）目的配列を分解することができるヌクレアーゼとを、目的配列がプローブにハイブリダイズするよりも前に、ヌクレアーゼを試料とプローブとに加えて混合することにより混合物を作製し、選択したパーセンテージでハイブリダイズさせ、これによって目的配列とプローブとの複合体を形成させること、およびｃ）その存在が目的配列の存在を意味する、複合体中の該検出可能な標識のレベルを測定することを含む方法。
請求項6
前記選択したハイブリダイゼーションのパーセンテージが約５〜９５％であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
請求項7
試料中に存在する少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を検出する方法であって、ａ）少なくとも１つの目的ヌクレオチド配列を含む可能性のある試料を提供すること、ｂ）ｉ）該試料と、ｉｉ）検出可能な標識で標識した少なくとも１つの核酸プローブと、ｉｉｉ）目的配列を分解することができるヌクレアーゼと、ｉｖ）少なくとも１つのフッ素界面活性剤とを混合して混合物を作製し、これによって目的配列とプローブとの複合体を形成させること、およびｃ）その存在が目的配列の存在を意味する、複合体中の該検出可能な標識のレベルを測定することを含む方法。
請求項8
前記フッ素界面活性剤が、陰イオンフッ素界面活性剤、陽イオンフッ素界面活性剤、両性（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ）フッ素界面活性剤、非イオンフッ素界面活性剤、両性イオン（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ）フッ素界面活性剤およびそれらの混合物の群から選ばれることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
請求項9
少なくとも１つのフッ素界面活性剤を加えることをさらに含む、請求項１、２、３、５のいずれかに記載の方法。
請求項10
前記少なくとも１つのフッ素界面活性剤が、陰イオンフッ素界面活性剤、陽イオンフッ素界面活性剤、両性（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ）フッ素界面活性剤、非イオンフッ素界面活性剤、両性イオン（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ）フッ素界面活性剤およびそれらの混合物からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
請求項11
前記混合物を作製する前に、前記試料から目的ヌクレオチド配列を抽出することをさらに含む、請求項１、２、３、５、７のいずれかに記載の方法。
請求項12
前記ヌクレアーゼが、ＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅＴ１、ＲＮａｓｅＩおよびＳ１ヌクレアーゼからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１、２、３、５、７のいずれかに記載の方法。
請求項13
前記複合体が固定化されていることを特徴とする、請求項１、２、３、５、７のいずれかに記載の方法。
請求項14
前記複合体を洗浄緩衝液で洗浄することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
請求項15
前記複合体に試薬基質を加えることをさらに含む、請求項１、２、３、５、７のいずれかに記載の方法。
請求項16
前記プローブがビオチンで標識された捕捉プローブとアルカリホスファターゼで標識されたシグナルプローブとを含むことを特徴とする、請求項１、２、３、５、７のいずれかに記載の方法。
請求項17
前記複合体に試薬基質を加えることをさらに含み、該試薬基質が、アダマンチル−１，２−ジオキセタンリン酸、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウム、およびパラニトロフェニルリン酸からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
請求項18
ａ）検出可能な標識で標識した少なくとも１つの核酸プローブ、ｂ）少なくとも１つのフッ素界面活性剤、およびｃ）目的のヌクレオチド配列を分解することができるヌクレアーゼを含むキット。
請求項19
前記キットの使用説明書をさらに含む、請求項１８に記載のキット。
請求項20
基質試薬をさらに含む、請求項１８に記載のキット。
請求項21
試料中に存在する目的とする標的を検出する方法であって、ａ）目的とする標的を含む可能性のある試料を提供すること、ｂ）ｉ）該試料と、ｉｉ）検出可能な標識で標識した少なくとも１つのプローブと、ｉｉｉ）少なくとも１つのフッ素界面活性剤とを混合して混合物を作製し、これによって目的とする標的とプローブとの複合体を形成させること、およびｃ）その存在が目的とする標的の存在を意味する、複合体中の該検出可能な標識のレベルを測定することを含む方法。
請求項22
前記少なくとも１つのフッ素界面活性剤が、陰イオンフッ素界面活性剤、陽イオンフッ素界面活性剤、両性（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ）フッ素界面活性剤、非イオンフッ素界面活性剤、両性イオン（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ）フッ素界面活性剤およびそれらの混合物からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
請求項23
前記目的とする標的が、タンパク質、ペプチド、小型化学分子（ｓｍａｌｌｃｈｅｍｉｃａｌｍｏｌｅｃｕｌｅ）、炭水化物、リポ多糖、多糖、および脂質からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
請求項24
細胞、細胞内小器官、生体分子または化学分子の非特異結合を低減させる方法であって、ａ）少なくとも１つのフッ素界面活性剤を緩衝液に加えること、およびｂ）該細胞、細胞内小器官、生体分子または化学分子を該緩衝液と接触させることを含み、該少なくとも１つのフッ素界面活性剤の存在によって、該細胞、細胞内小器官、生体分子または化学分子の、表面へのもしくは相互間の非特異結合が低減することを特徴とする方法。
請求項25
前記少なくとも１つのフッ素界面活性剤が、陰イオンフッ素界面活性剤、陽イオンフッ素界面活性剤、両性（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ）フッ素界面活性剤、非イオンフッ素界面活性剤、両性イオン（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ）フッ素界面活性剤およびそれらの混合物からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
請求項26
前記アプリケーションが、免疫測定、マイクロ流体分析、ベッセル表面の不動態化、および細胞培養からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
請求項27
ａ）検出可能な標識で標識した少なくとも１つの核酸プローブ、ｂ）少なくとも１つのフッ素界面活性剤、およびｃ）目的の配列を分解することができるヌクレアーゼを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法で使用するためのキット。
請求項28
前記キットの使用説明書をさらに含む、請求項２７に記載のキット。
請求項29
基質試薬をさらに含む、請求項２７に記載のキット。